Studie zum Klärungsprozess von hochdichtem Fermentationslysat von rekombinantem Escherichia Coli

 

Um die Interferenz der Materialflüssigkeit mit der Chromatographie zu verringern und die Rückgewinnung des Zielproteins zu verbessern, wurde der Klärungsprozess von hochdichten Fermentationslysaten zweier Stämme rekombinanter Escherichia coli untersucht. Ausgewählt wurden die Stämme BL21-HP1036 und BL21-palA, die Schlüsselgene von Streptococcus suis und Haemophilus parasuis exprimieren. Tangentialflussverfahren, Hochgeschwindigkeitszentrifugationsverfahren und Membrankassettenklärungsverfahren wurden verwendet, um die Proteinausbeute durch Trübungs- und Elektrophoreseerkennung zu bewerten.

 

Die Ergebnisse zeigten, dass BL21-HP1036, BL21-palA-Fermentationslysat mit hoher Dichte, das Schlüsselgene von Streptococcus suis und Haemophilus parasuis exprimiert, durch Membrankassettenfiltration und Zentrifugation geklärt wurden und die Proteinausbeute über 80 % lag, wodurch die chromatographischen Interferenzen wirksam reduziert und die Rückgewinnungsrate verbessert werden konnte.

 

Einführung

Derzeit sind Streptococcus suis (SS) und Haemophilus parasuis (HPS) die häufigsten bakteriellen Krankheitserreger in Schweinefarmen, die der Schweineindustrie große Verluste bescheren. SS kann in insgesamt 35 Serotypen 1-34 und 1/2 unterteilt werden, und HPS kann in 1-15 Serotypen unterteilt werden, und die beiden treten häufig gemischt auf und verursachen hauptsächlich Polyserositis, Arthritis, Meningitis, Endokarditis, bakterielle Septikämie und Bronchitis bei Schweinen.

 

Aufgrund der großen Anzahl an Serotypen von Streptococcus suis und Haemophilus parasuis ist der Kreuzschutz zwischen verschiedenen Serotypen schwach und die Antibiotikaresistenz nimmt bei einer Behandlung mit Antibiotika erheblich zu, was die therapeutische Wirkung beeinträchtigt.

 

Impfstoffe sind zu einem wirksamen Mittel zur Vorbeugung von SS und HPS geworden. Es gibt inaktivierte Impfstoffe, abgeschwächte Impfstoffe, Lebendimpfstoffe, Untereinheitenimpfstoffe und gentechnisch veränderte Impfstoffe, aber inaktivierte Impfstoffe und abgeschwächte Impfstoffe sind hauptsächlich auf dem Markt und bieten einen guten Immunschutz, aber keinen offensichtlichen Kreuzschutz. Untereinheitenimpfstoffe sind ein neuer Impfstofftyp gegen Streptococcus suis, ein neuer Impfstofftyp mit starkem Kreuzschutz und niedrigem Preis. Die Forschung und Entwicklung von Untereinheitenimpfstoffen gegen Streptococcus suis und Haemophilus parasuis bietet eine perfekte Lösung für die Präventions- und Kontrollprobleme von Streptococcus suis und Haemophilus parasuis, die die Schweineindustrie in China plagen.

 

Streptococcus suis- und Haemophilus parasuis-Untereinheitenimpfstoffe werden einer Hochdichtefermentation durch rekombinante Escherichia coli unterzogen. Die Klärung des Lysats hat einen großen Einfluss auf die Ausbeute der Zielproteine, es gibt jedoch nur wenige entsprechende Berichte. Wie der Klärungsschritt des Fermentations- und Reinigungsprozesses realisiert wird, ist eine wichtige Arbeit. In diesem Artikel wird die Hochdichtefermentation von rekombinanten E. coli BL21-HP1036, BL21-palA als Ziel genommen. Es wird untersucht, wie die Trübung der Klärlösung effizient reduziert und die Proteinausbeute verbessert werden kann, um den Fermentationsprozess von Streptococcus suis-Untereinheitenimpfstoffen zu erreichen und eine industrielle Zerkleinerungs- und Klärungstechnologie zu erreichen, um theoretische Grundlagen und technische Unterstützung zu bieten.

 

1. Materialien und Methoden

1.1 Materialien

 

1.1.1 Stämme

Streptococcus suis- und Haemophilus parasuis-Stämme BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Wichtigste Medien und Reagenzien

Hefeextrakt und Schweinswal; Natriumchlorid; Kanamycin, IPTG; Formaldehyd aus; SDS-PAGE-Gel-Kit.

 

1.1.3 Wichtigste Prüfgeräte

Hochdichtefermenter; Hochgeschwindigkeitszentrifuge; Elektrophoresegerät; Ultraviolett-Gelbildgebungssystem; Ultraschallzerkleinerer; Kleine Hochgeschwindigkeitszentrifuge; Ultraviolett-Spektralphotometer; Schütteltisch mit konstanter Temperatur; Ausrüstung für die Affinitätschromatographie.

 

1.2 Methoden

 

1.2.1 Hochdichte Fermentationskultur

Die qualifizierten rekombinanten Coliformenstämme BL21-HP1036 und BL21-pa-lA wurden auf synthetischem Medium mit 2 % (V/V) inokuliert und 35-40 Stunden lang bei 37 Grad kultiviert.

 

1.2.2 Durch rekombinantes Protein induzierte Expression

Als die Fermentationslösung eine OD{{0}}±0.1 betrug, begann die Induktion, die Induktionstemperatur betrug 35 Grad ±0,5 Grad und die Kultur wurde nach 10 Stunden Induktion beendet.

 

1.2.3 Homogene Hochdruckzerkleinerung und Zentrifugation

Die Bakterienflüssigkeit, die den Inaktivierungstest bestanden hatte, wurde mit einem Hochdruckhomogenisator zerkleinert, um die Zellen aufzubrechen. Der Druck betrug 100–150 MPa. Nach dem Zerkleinern wurde die zerkleinerte Flüssigkeit bei niedriger Temperatur aufbewahrt.

Das Überstand wurde durch Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit gewonnen (Zentrifugalgeschwindigkeit: 15000 U/min, Temperaturkontrolle: 10–15 Grad, Injektionsgeschwindigkeit: 0,5–1 l/min), der Überstand wurde gesammelt und in Behälter gefüllt, um das Endotoxin zu entfernen.

 

1.2.4 Mikrofiltrationsmembran-Kassettenklärung

Die Membran wurde in einer Richtung mit 10L gereinigtem Wasser gewaschen und eine Tangentialflussfiltration durchgeführt. 300 ml der zerkleinerten Bakteriensuspension wurden nach der Zentrifugation aus der Rohrleitungszentrifuge entnommen und mit einer 0,45-µm-Mikrofiltrationsmembrankassette geklärt. Die Trübung wurde jeweils durch Probenentnahme gemessen und die Trübung nach der Zentrifugation, die Trübung der geklärten Flüssigkeit in der Mikrofiltrationsmembrankassette und die Trübung der konzentrierten Flüssigkeit in der Mikrofiltrationsmembrankassette wurden verglichen. Der Proteingehalt der Probe wurde durch Chromatographie und Elektrophorese ermittelt, um die Proteinausbeute zu ermitteln.

 

Schritt 2: Ergebnisse

2.1 Klärungsdaten und Testergebnisse des BL21-HP1036- und BL21-palA-Proteins

Die Ergebnisse in Abb. 1 zeigen, dass die Trübung der BL21-HP1036- und BL21-palA-rekombinanten Escherichia coli-Zerkleinerungsflüssigkeit nach der Röhrchenzentrifugation von 4 500 NTU und 4 000 NTU auf 1970 NTU bzw. 520 NTU abnahm. Die Trübung der BL21-HP1036- und BL21-palA-rekombinanten Escherichia coli wurde durch die Mikrofiltrationsmembrankassettenmethode auf 25 NTU und 1,28 NTU reduziert. Es ist ersichtlich, dass die Verwendung der Mikrofiltrationsmembrankassetten-Tangentialflussfiltration und des optimierten offenen Flusskanals eine bessere Wirkung auf die Reduzierung von Endotoxin, Viskosität und Trübung der chromatographischen Flüssigkeit hat als die herkömmliche Zentrifugenfiltration und das zerstörte rekombinante E. coli-Heteroprotein und die Nukleinsäure deutlich reduzieren kann.

 

2.2 Proteinrückgewinnung von BL21-HP1036- und BL21-palA-Proben

Tabelle 1 zeigt, dass rekombinantes Escherichia coli BL21-HP1036-Protein sowohl in der durch Mikrofiltration geklärten Lösung als auch im konzentrierten Überstand vorhanden ist, der von der Mikrofiltrationsmembran bedeckt ist, und dass die Gesamtproteinausbeute nach Rückgewinnung des Proteins aus der durch Mikrofiltration geklärten Lösung und dem konzentrierten Überstand etwa 88,5 % beträgt. BL21-palA-Protein war auch in der durch Mikrofiltration geklärten Lösung des Exsudats und im Überstand der konzentrierten Lösung vorhanden, der von der Mikrofiltrationsmembrankassette bedeckt ist. Die Gesamtausbeute des BL21-PALa-Proteins betrug 81,5 %.

 

3. Fazit

In dieser Arbeit wurden die Stämme, die die Schlüsselgene BL{{0}}HP1036 und BL21-palA von Streptococcus suis und Haemophilus parasuis exprimieren, einer Hochdichtefermentation unterzogen und durchliefen 0,45. Die Trübung der Materialflüssigkeit wurde durch das Verfahren mit der UM-Mikrofiltrationsmembrankassette deutlich reduziert, was darauf hindeutet, dass die Tangentialflussfiltrationstechnologie mit der Mikrofiltrationsmembrankassette besser war als die mit der Hochgeschwindigkeitszentrifuge und die Protein- und Nukleinsäureverunreinigungen des aufgebrochenen rekombinanten Escherichia coli deutlich reduzieren konnte.

 

Nach dem Sammeln der klaren Flüssigkeit in der einzelnen Mikrofiltrationsmembrankassette waren 62,9 % vorhanden. Da 37,1 % des Zielproteins von BL21-HP1036 Mikrofiltrationskonzentrat waren oder in der Mikrofiltrationsmembrankassette und anderen Verlusten vorhanden waren, wurde zur Klärung eine zweistufige Methode angewendet. Im ersten Schritt wurde eine 0,45-µm-Mikrofiltrationsmembrankassette verwendet, um das Exsudat zu klären und zu sammeln; im zweiten Schritt wurde die verbleibende konzentrierte Flüssigkeit nach der Röhrchenzentrifugation gesammelt und die in zwei Schritten geklärte Flüssigkeit wurde als chromatographische Probe kombiniert. Der Trübungswert der BL21-palA-Fermentationsflüssigkeit stieg nicht signifikant an, die Proteinausbeute konnte über 85,5 % erreichen und die Proteinausbeute der BL21-Pala-Fermentationsflüssigkeit konnte nach der zweistufigen Behandlung 81,5 % erreichen.

 

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