Nachgeschalteter Ultrafiltrations-/Diafiltrations-Konzentrationsprozess: So verhindern Sie effektiv die Permeation und den Verlust von Zielproteinen

Nachgeschalteter Ultrafiltrations-/Diafiltrations-Konzentrationsprozess: So verhindern Sie wirksam die Permeation und den Verlust von Zielproteinen

In nachgelagerten Reinigungsprozessen für rekombinante Proteine, Blutprodukte und andere Biologika wird Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF) zur Rohstoffkonzentration, zum Pufferaustausch und zur Entfernung von Salzen und kleinen Molekülverunreinigungen eingesetzt. Die Trennung erfolgt durch Membransiebung: Große Moleküle wie monoklonale Antikörper (mAbs) werden von der Membran zurückgehalten, während Salze, Endotoxine, freie Wirtszellproteine ​​(HCPs) und andere kleinmolekulare Verunreinigungen durch die Membran gelangen und im Permeat entfernt werden. Während der Prozessskalierung-kann es leicht zu einem Verlust des Zielproteins durch die Membran kommen, was die Ausbeute direkt verringert und die Chargenkosten erhöht. Unter bestimmten Betriebsbedingungen kann Protein im Permeat nachgewiesen werden, was eine schnelle Bestimmung erfordert, ob es sich bei den ausgetretenen Komponenten um intakte Ziel-mAb, abgebaute/fragmentierte Aggregate oder Wirtszellproteine ​​handelt. Dieser Artikel ist in zwei Hauptteile gegliedert: Er gibt einen Überblick über herkömmliche Prozesskontrollansätze und erstellt in Kombination mit Design of Experiments (DOE) ein robustes Prozessfenster, das durch mehrere Analysemethoden unterstützt wird, um die Identität der im Permeat nachgewiesenen Proteine ​​zu bestimmen.

 

 

I. Hauptursachen für die Permeation von Zielproteinen durch die Membran während UF/DF

1. Übermäßiger Transmembrandruck (TMP)
Wenn der Druckunterschied über die Membran zu hoch ist, erhöht sich der Lösungsmittelwiderstand, wodurch etwas Monomerprotein in das Permeat gedrückt wird. Während der Maßstabsvergrößerung- enthält der Zufuhrtank ein größeres Materialvolumen und Druckschwankungen in den Rohrleitungen sind ausgeprägter, wodurch ein vorübergehender Überdruck wahrscheinlicher ist als im Labormaßstab.

2. Falsche tangentiale Durchflussrate
Wenn die Flussrate zu niedrig ist, bildet sich auf der Membranoberfläche eine dichte Polarisationskonzentration-und die lokale Proteinkonzentration kann die Toleranzschwelle der Membran überschreiten. Wenn die Flussrate zu hoch ist, kann die Scherbeanspruchung zu einer strukturellen Spaltung des mAb führen, wodurch kleinere Proteinfragmente entstehen, die frei durch die Membranporen gelangen können.

3. Zu hohe Proteinkonzentration im Ausgangsmaterial
Wenn die Proteinkonzentration im Feed zu hoch ist, reichert sich Protein an der Membranoberfläche an und ein Teil des Monomerproteins kann in das Permeat transportiert werden. Dies ist ein häufiges Problem bei der Massenproduktion-.

4. pH-Wert oder Leitfähigkeit außerhalb des Prozessbereichs
Änderungen in den Ladungseigenschaften des Proteins können seinen Hydratationsradius und seine scheinbare Partikelgröße verringern, was zu einer abnormalen Membranpermeation führt.

5. Alterung der Membrankassette, hoher Diffusionsfluss oder unzureichende Vorkonditionierung
Physische Defekte in der Membrankassette können direkt zum Austreten von Proteinen führen und ein gerätebezogenes Risiko darstellen. Wiederholtes CIP mit stark alkalischen Lösungen kann das Polyethersulfon (PES)-Membranmaterial allmählich beschädigen.

6. Zu großes Diafiltrationsvolumen
Bei längerer Diafiltration können durch kontinuierliches Spülen mit Lösungsmittel nach und nach kleine Mengen an Monomerprotein entfernt werden.

 

II. Traditionelle praktische Maßnahmen zur Verhinderung der Permeation und des Verlusts von Zielproteinen

(A) Prozessparametersteuerung

1. Kontrollieren Sie den Transmembrandruck (TMP)
Definieren Sie eine obere Druckwarngrenze und richten Sie Verriegelungsalarme ein, um vorübergehende hohe{0}Druckauswirkungen auf die Membranschicht zu verhindern. Reduzieren Sie nach der Bestimmung der Basisparameter im kleinen Maßstab den sicheren Betriebsdruck während der Hochskalierung der Produktion und reservieren Sie einen geeigneten Prozesstoleranzbereich.

2. Optimieren Sie die Querstromrate
Schaffen Sie eine stabile Grenzschicht und reduzieren Sie die Konzentrationspolarisierung an der Membranoberfläche durch Querströmung, wodurch die Proteinansammlung auf der Membranoberfläche an der Quelle minimiert wird.

3. Begrenzen Sie die Endkonzentration nach der Konzentration
Definieren Sie einen Konzentrationsgrenzwert basierend auf den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Proteins und vermeiden Sie eine übermäßige Futterkonzentration. Bei mAbs überschreitet die routinemäßige Endkonzentration im Allgemeinen nicht 50 mg/ml; Bei einigen zur Aggregation-anfälligen mAbs sollte die Konzentration weiter reduziert werden.

4. Kontrollieren Sie den pH-Wert und die Leitfähigkeit des Futters
Behalten Sie eine stabile hydratisierte Partikelgröße des Proteins bei und vermeiden Sie eine molekulare Kontraktion, die durch Störungen der Säure/Base oder der Ionenstärke verursacht wird.

(B) Ausrüstung und Betriebskontrollen

1. Führen Sie vor jeder Charge einen Integritätstest der Membrankassette durch
Führen Sie vor der Produktion jeder Charge einen Blasenpunkttest durch, um gebrochene Membranfasern zu identifizieren. Beschädigte Membrankassetten sollten sofort entsorgt werden, um ein kontinuierliches Austreten von Protein zu verhindern.

2. Standardisieren Sie das CIP-Reinigungsverfahren
Kontrollieren Sie die NaOH-Konzentration und die Kontaktzeit. Nach einer stark alkalischen Reinigung das Membranmaterial vollständig äquilibrieren, um das Risiko einer Membranporenverformung zu verringern.

3. Verwenden Sie eine abgestufte Diafiltration
Verwenden Sie im Frühstadium einen großvolumigen Pufferaustausch, um Salze zu entfernen, und verlangsamen Sie die Diafiltrationsflussrate, wenn sich der Endpunkt nähert, um Proteinwiderstand und -verlust zu reduzieren.

 

III. Einrichtung eines Prozessdesignraums durch DOE (QbD Process Characterization; anwendbar für IND-Einreichung)

1. Faktorenscreening
Überprüfen Sie fünf wichtige UF/DF-Prozessparameter (P): Transmembrandruck, Feed-Durchflussrate, anfängliche Proteinkonzentration, Feed-pH und Betriebstemperatur.
Antwortvariablen: zurückbehaltene Ausbeute, Proteingehalt im Permeat, Membranfluss und Prozentsatz hoch-molekularer-Aggregate.

Identifizieren Sie durch Signifikanzanalyse die Schlüsselfaktoren, die zur Proteinleckage beitragen.

2. Modellierung der Reaktionsoberfläche
Wählen Sie die vier Parameter mit der höchsten Bedeutung aus, um eine Antwortoberfläche zu erstellen und Wechselwirkungen zwischen Parametern zu analysieren. Unter vielen Betriebsbedingungen kann ein einzelner Parameter innerhalb seines zulässigen Bereichs bleiben, während die Kombination zweier Parameter zu einer Proteinpermeation führen kann. Solche Interaktionseffekte können nicht durch herkömmliche Experimente mit jeweils einem {{2}Faktor-jeweils einem -Faktor identifiziert werden. Definieren Sie basierend auf dem Modell einen funktionsfähigen Designraum. Solange die Prozessparameter innerhalb dieses Bereichs bleiben, kann eine effektive Proteinretention gewährleistet werden, während Verunreinigungen durch Diafiltration entfernt werden.

3. Worst-Case-Herausforderung (erforderlich für die Prozesscharakterisierung)
Wählen Sie Prozessparameter an den Extremen der Betriebsgrenzen aus, um die Herstellungsvariabilität zu simulieren: maximales TMP, minimale Querstromrate und obere -Grenzwert-Proteinkonzentration. Stellen Sie sicher, dass es auch unter extremen Betriebsbedingungen nicht zu einem großflächigen Zielproteinverlust kommt, und erfüllen Sie so die Anforderungen der CMC-Prüfung.

 

IV. Mehrere analytische Methoden zur Identifizierung der im Permeat nachgewiesenen Proteine ​​und zur Unterscheidung von Ziel-mAb, Abbaufragmenten und HCP

Basierend auf Analyseeffizienz, Kosten und behördlichen Einreichungsszenarien können die Methoden in zwei Kategorien unterteilt werden: Schnellscreening und Bestätigungstests. Bei der routinemäßigen Prozessüberwachung sollten schnelle Methoden Vorrang haben; Wenn abnormale Abweichungen auftreten, sollten genaue Identifizierungsmethoden verwendet werden.

1. UV-Spektrophotometrie (schnelles Online-Screening; bevorzugt für routinemäßige Werkstattüberwachung)
Sammeln Sie das Permeat und messen Sie dessen A280-Absorption. Dadurch kann nur festgestellt werden, ob Protein im Permeat vorhanden ist, es kann jedoch nicht zwischen den Proteinarten unterschieden werden. Es wird hauptsächlich zur routinemäßigen Prozessüberwachung eingesetzt. Ein kontinuierlich steigender A280-Wert weist auf eine zunehmende Proteinleckage hin und erfordert eine sofortige Unterbrechung der Diafiltration und eine Untersuchung des Prozesses.

2. SDS-PAGE-Elektrophorese (am häufigsten verwendete qualitative Identifizierungsmethode)
Verwenden Sie reduzierende und nicht{0}}reduzierende Elektrophorese und vergleichen Sie die Bandenpositionen mit denen des Ziel-mAb im Ausgangsmaterial:
1) Wenn die Bandenposition vollständig mit dem Ziel-mAb übereinstimmt, hat intakter mAb die Membran durchdrungen.
2) Wenn Banden mit niedrigerem-molekularem-Gewicht auftreten, wurde das Protein einer hydrolytischen Spaltung unterzogen, wodurch mAb-Fragmente entstanden sind.
3) Wenn die Banden mit mehreren verschiedenen Banden verstreut sind, handelt es sich bei den meisten um Wirtszellproteine ​​(HCPs) aus E. coli/CHO-Wirtszellen und nicht um das Zielprodukt.

3. Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie (HPSEC)
Trennen Sie die Komponenten nach Molekülgröße und vergleichen Sie ihre Elutionszeiten mit denen des Feedstock-Chromatogramms:
- Ein Hauptpeak mit derselben Retentionszeit wie der mAb weist auf ein intaktes Zielprotein hin.
- Ein früher eluierender Peak weist auf hoch-molekulare-Aggregate/Fragmente hin.
- Ein später eluierender Peak weist auf Abbaufragmente mit niedrigem-molekularem-Gewicht hin.
- Das Fehlen eines charakteristischen Hauptpeaks weist auf HCP-Verunreinigungsproteine ​​hin.
Diese Methode kann quantitative Daten liefern und in Untersuchungsberichte zu Prozessabweichungen einbezogen werden; Es genießt eine hohe Akzeptanz in den klinischen Einreichungsmaterialien.

4. Testen des HCP-Wirtszellprotein-ELISA-Kits
Wenn Protein im Permeat nachgewiesen wird, das ELISA-Ergebnis erhöht ist und HPSEC keinen charakteristischen mAb-Peak zeigt, kann das ausgetretene Material grundsätzlich als CHO-Wirtszellproteine ​​identifiziert werden. Dies weist auf eine unvollständige Entfernung von Verunreinigungen während der vorgeschalteten Reinigung hin; Die Verunreinigungen werden während der UF/DF-Stufe ausgewaschen und stellen keinen Produktverlust dar.

5. Überprüfung der Affinitätschromatographie (Protein-A-Chromatographie)
Protein A bindet spezifisch die Fc-Region von mAbs. Laden Sie die Permeatprobe auf die Säule: Das Erscheinen eines charakteristischen Elutionspeaks weist auf das Vorhandensein eines intakten Zielantikörpers hin. Das Fehlen eines Elutionspeaks zeigt, dass es sich bei den Proteinen im Permeat ausschließlich um Verunreinigungsproteine ​​handelt.

6. Massenspektrometrie (LC-MS) (tiefgehende Rückverfolgbarkeit; wird zur Untersuchung wesentlicher Prozessabweichungen verwendet)
LC-MS kann die Aminosäuresequenz direkt analysieren und den Ursprung des Proteins genau bestimmen. Es wird hauptsächlich zur Untersuchung schwieriger oder ungewöhnlicher Abweichungen verwendet und nicht als Routine--Prozesskontrolltest.

V. Korrekturmaßnahmen entsprechend unterschiedlichen Analyseergebnissen

1. Intakter Ziel-mAb im Permeat nachgewiesen
Reduzieren Sie den Transmembrandruck und die Endkonzentration nach der Konzentration; Den Betriebsbereich des Prozesses basierend auf den DOE-Ergebnissen eingrenzen; und überprüfen Sie die Unversehrtheit der Membrankassette.

2. Im Permeat nachgewiesene Antikörperabbaufragmente
Untersuchen Sie die Scherspannung während des gesamten Prozesses und die pH-Extreme. Optimieren Sie den vorgeschalteten Schritt der Virusinaktivierung, um die Proteinspaltung zu reduzieren.

3. Im Permeat wurden nur HCP-Verunreinigungsproteine ​​nachgewiesen
Es ist keine Anpassung der UF/DF-Parameter erforderlich. Verfolgen Sie das Problem auf die vorherigen Chromatographieschritte zurück und verbessern Sie die Entfernung von Verunreinigungen während der Affinitäts- und Ionenaustauschchromatographie.

 

VI. Zusammenfassung

Um ein Austreten von Proteinen während der UF/DF zu verhindern, stützt sich die herkömmliche Prozesssteuerung auf historische Erfahrungen, um individuelle Punktparameter zu definieren, die nur eine stabile Produktion im kleinen -Maßstab angemessen bewältigen können. Um eine stabile Leistung während der schrittweisen Prozessskalierung-zu gewährleisten, sollte eine DOE-basierte Prozesscharakterisierung verwendet werden, um einen Prozessdesignraum mit ausreichender Toleranz festzulegen. Eine intervallbasierte Parametersteuerung kann Fertigungsschwankungen ausgleichen. Sobald Protein im Permeat nachgewiesen wird, kann ein einfaches UV-Detektionssystem eine erste Warnung liefern, gefolgt von Elektrophorese, HPSEC und ELISA zur Rückverfolgbarkeit und Identifizierung. Dies ermöglicht eine genaue Unterscheidung zwischen dem Zielprodukt und Wirtszellverunreinigungen und ermöglicht so eine gezielte Untersuchung der Grundursache und Korrekturmaßnahmen. Dies ist auch eine standardisierte Forschungskomponente, die derzeit in der CMC-Dokumentation für mAb-Projekte enthalten ist.