So wählen Sie das geeignete Ultrafiltrationsrohr aus
Ultrafiltrationsröhrchen, die üblicherweise für die Proteinkonzentration und den Pufferersatz verwendet werden, werden häufig in Ultrafiltrationsröhrchen verwendet. Es gibt andere Modelle, die unterschiedliche Volumengrößen und Ultrafiltrationsröhrchen haben, abhängig vom Molekulargewicht des Zielproteins, dem Volumen vor der Konzentration und dem Zielvolumen der Konzentration. Mehrweg.
1. Wählen Sie ein geeignetes Ultrafiltrationsrohr, wobei hauptsächlich MWCO und Konzentrationsvolumen berücksichtigt werden. Im Allgemeinen sollte das Molekulargewicht nicht größer als 1 / 3 des Molekulargewichts des Zielproteins sein. Wenn das Molekulargewicht des Zielproteins etwa 10 kd beträgt, kann ein Ultrafiltrationsröhrchen mit einem zurückgehaltenen Molekulargewicht von 3 KD verwendet werden.
2. Die neu erworbene Ultrafiltration ist trocken. Fügen Sie vor dem Gebrauch milliq Wasser hinzu. Das Wasser durchläuft die Membran vollständig und wird in einem Eisbad oder Kühlschrank für einige Minuten vorgekühlt. Dann gießen Sie das Wasser aus, um die Proteinlösung hinzuzufügen. Die Menge an Proteinlösung darf die weiße Linie auf der Oberseite des Reagenzglases nicht überschreiten. Einfache Bedienung. Vor der Zugabe der Proteinlösung muss das Ultrafiltrationsröhrchen zur Vorkühlung in das Eis eingeführt werden.
3. Guthaben. Masse und Schwerpunkt müssen ausbalanciert sein. Beachten Sie, dass die Geschwindigkeit und Beschleunigung nicht zu schnell sein sollte, da sonst die Ultrafiltrationsmembran direkt beschädigt wird. Starten Sie die zentrifugale Ultrafiltration (Vorkühlung der Zentrifuge auf 4 Grad). Die Richtung der Membran und der rotierenden Welle kann gemäß den Anweisungen eingestellt werden (im Falle einer Winkelzentrifuge steht die Membran senkrecht zur Welle). Im tatsächlichen Gebrauch ist die allgemeine Geschwindigkeit niedriger als in der Bedienungsanleitung angegeben, was die Lebensdauer des Zentrifugalrohrs verlängern kann.
4. Wenn auf die verbleibenden 1 ml konzentriert, [nehmen Sie die 50-ul-Haushaltslösung Bradford, fügen Sie 10 μl Flüssigkeit hinzu, um zu sehen, ob sie blau wird, und stellen Sie fest, ob das Ultrafiltrationsröhrchen das Protein austritt. Wenn das Rohr undicht ist, gießen Sie es in die obere Schicht und fließen Sie dann zurück zum neuen Rohr, um die Ultrafiltration zu starten. Um genau zu bestimmen, ob das Reagenzglas undicht ist, bitte 5mg 10min Zentrifuge 10min, dann passieren Sie es, lassen Sie das Proteingel oder Bradford] [Grobmessung] laufen. Fügen Sie weiterhin die verbleibende Proteinlösung zum Konzentrieren hinzu (arbeiten Sie auf Eis, um eine Proteinerwärmung zu verhindern), bis alle konzentrierten Lösungen hinzugefügt werden. Achten Sie bei der Zentrifugation darauf, ob eine Proteinausfällung auftritt und eine Röhrchenverstopfung verursacht. Wenn Niederschlag auftritt, bestimmen Sie bitte die spezifische Ursache des Niederschlags, ob die Proteinkonzentration zu hoch ist oder ob der Puffer ungeeignet ist; Ersteres kann gelöst werden, indem mehrere Ultrafiltrationsröhrchen gleichzeitig verwendet werden, um die Konzentration zu reduzieren, während letzteres verschiedene Puffer ändern kann, bis das Protein ausfällt.
5. Die vorherigen Schritte werden verwendet, um Protein zu konzentrieren. Wenn der Puffer ersetzt werden soll, wenn die gesamte Proteinlösung auf etwa 1 ml konzentriert ist, fügen Sie vorsichtig einen neuen Puffer hinzu (Ultrafiltration durch 0,22 μm Ultrafiltrationsmembran) und konzentrieren Sie sich dann dreimal kontinuierlich auf etwa 1 ml, so dass die endgültige Konzentration von der erforderlichen Proteinkonzentration abhängt, die normalerweise nicht mehr als 500 μl oder weniger als 200 μl beträgt. Nach der Volumenkonzentration von mindestens 10 mal jedes Mal ist es mehr als das 1000-fache der dreimal, was im Grunde den Zweck des Wechsels des Puffers erreichen kann.
6. Entfernen Sie das endgültige Proteinkonzentrat. Operiere auf Eis. Verwenden Sie eine gelbe Pipettenspitze (200ul) und führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig am Rand ein, blasen und mischen Sie die Proteinlösung vorsichtig. Achten Sie darauf, die Ultrafiltrationsmembran nicht zu berühren. Saugen Sie die konzentrierte Lösung jedes Mal auf 200ul, bis sie vollständig abgesaugt ist. Es ist nicht notwendig, die letzte konzentrierte Lösung am Boden des Reagenzglases zu extrahieren, da es sonst zu schwierig ist und die Ultrafiltrationsmembran beschädigt werden kann. Schließlich wird dem Ultrafiltrationsrohr Milliq-Wasser zugesetzt, ohne die Ultrafiltrationsmembran zu passieren, um Wasserverlust und Trocknung der Membran zu verhindern.
7. Im Folgenden finden Sie die Schritte zur Behandlung des Ultrafiltrationsrohrs und zur Wiederverwendung des Ultrafiltrationsrohrs.
8. Gießen Sie Wasser in das Ultrafiltrationsrohr und spülen Sie es mehrmals vorsichtig mit milliq Wasser ab. [Wenn am Boden des Reagenzglases eine offensichtliche Proteinausfällung auftritt, können Sie zuerst Wasser hinzufügen und es dann mit einer Pipette wegblasen. Achten Sie darauf, die Membran nicht zu berühren. Das Sediment hängt herunter und läuft dann weg. Sie können es nicht mit Leitungswasser spülen. Nachdem Sie 0,2 m NaOH-Lösung hinzugefügt haben, legen Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und gleichen Sie das Ultrafiltrationsrohr während dieser Zeit aus. Weitere 10 Minuten zentrifugieren. Gießen Sie die verbleibende NaOH-Lösung aus und tauchen Sie den Baumwollkern in das Becherglas (1 oder 2L) Milliq-Wasser, das für mehrere Stunden platziert und dann durch neues Wasser ersetzt wird, das für mehrere Stunden platziert wird, um die Konzentration von NaOH kontinuierlich zu verdünnen. Waschen Sie das 50ml Reagenzglas und bedecken Sie es mit Leitungswasser und waschen Sie die Innenwand mit milliq Wasser.
9. Nehmen Sie den eingetauchten Reagenzglaskern heraus, fügen Sie ihn dem vollen milliq Wasser hinzu und füllen Sie dann das 50ml Reagenzglas mit milliq Wasser. Langsam den Röhrenkern in 50ml geben.
Zentrifugenröhrchen, Wasser abtropfen lassen und teilen, dann abdecken und bis zum nächsten Gebrauch bei 4 Grad lagern. Im Allgemeinen wird gemäß den oben genannten Schritten und Vorsichtsmaßnahmen jede Röhre nicht innerhalb von drei oder vier Jahren brechen.
