Vorsichtsmaßnahmen für die Verwendung von Ultrafiltrationsrohren
(1) Wählen Sie das geeignete Ultrafiltrationsrohr aus. Im Allgemeinen sollte das zurückzuhaltende Molekulargewicht nicht größer als 1 / 3 des Molekulargewichts des Zielproteins sein. Wenn beispielsweise das Molekulargewicht des Zielproteins 35 kDa beträgt, kann das Ultrafiltrationsröhrchen mit 10 kDa Molekulargewicht ausgewählt werden. Wenn das Molekulargewicht des Zielproteins etwa 10 kd beträgt, kann ein Ultrafiltrationsröhrchen mit einem Molekulargewicht von 3 KD verwendet werden. Lesen Sie die Bedienungsanleitung sorgfältig durch und achten Sie auf die unterschiedliche Toleranz der Ultrafiltrationsmembran gegenüber verschiedenen Chemikalien.
(2) Die neu gekaufte Ultrafiltration ist trocken. Fügen Sie vor dem Gebrauch Reinstwasser hinzu, und das Wasser wird vollständig durch die Membran geleitet. Kühlen Sie es in einem Eisbad oder Kühlschrank für einige Minuten vor. Dann gießen Sie das Wasser aus und fügen Sie die Proteinlösung hinzu. Die zugesetzte Menge darf die weiße Linie auf der Oberseite des Rohres nicht überschreiten. Die Bedienung sollte leicht sein. Vor der Zugabe von Proteinlösung muss das Ultrafiltrationsröhrchen zur Vorkühlung auf Eis eingeführt werden.
(3) Guthaben. Sowohl Masse als auch Schwerpunkt sollten ausgeglichen sein. Beachten Sie, dass die Geschwindigkeit und Beschleunigung nicht zu schnell sein sollte, da sonst die Ultrafiltrationsmembran direkt beschädigt wird. Starten Sie die zentrifugale Ultrafiltration (Zentrifugenvorkühlung auf 4 Grad). Nachdem die Drehzahl verschiedener Zentrifugen in G umgewandelt wurde, ist es anders. Stellen Sie die Beschleunigung der Zentrifuge auf den niedrigsten Gang ein, um den Druck auf die Membran zu reduzieren. Beachten Sie, dass Sie warten müssen, bis die Zentrifuge die Zielgeschwindigkeit erreicht hat, bevor Sie die Zentrifuge verlassen, da Sie sonst nicht beim ersten Mal damit umgehen können, wenn ein Problem mit der Zentrifuge auftritt. Die Richtung der Membran und der rotierenden Welle ist gemäß den Anweisungen einzustellen (im Falle einer Winkelzentrifuge steht die Membran senkrecht zur Welle). Im praktischen Einsatz ist die Drehzahl in der Regel niedriger als in der Hand, was die Lebensdauer des Zentrifugalrohres verlängern kann.
(4) Wenn es auf die restlichen 1 ml konzentriert ist, nehmen Sie 50 μl Pufferlösung und fügen Sie 10 μl hinzu, um zu sehen, ob es blau wird, um zu beurteilen, ob das Ultrafiltrationsröhrchen Protein austritt. Wenn das Rohr undicht ist, gießen Sie die obere Schicht und fließen Sie durch das neue Rohr und starten Sie die Ultrafiltration. Um genau zu beurteilen, ob das Röhrchen undicht ist, zentrifugieren Sie mit 5mgml BSA für 10min, nehmen Sie dann den Durchfluss, lassen Sie Proteinkleber oder Bradford für die grobe Messung laufen und fügen Sie die verbleibende Proteinlösung zur Konzentration hinzu (arbeiten Sie auf Eis, um zu verhindern, dass das Protein erhitzt wird), bis alle konzentrierten Lösungen hinzugefügt werden. Achten Sie darauf, ob während der Zentrifugation eine Proteinausfällung auftritt, die zu einer Rohrverstopfung führt. Wenn Niederschlag auftritt, bestimmen Sie die spezifische Ursache der Ausfällung, ob die Proteinkonzentration zu hoch ist oder der Puffer ungeeignet ist; Ersteres kann durch gleichzeitige Ultrafiltration mit mehreren Ultrafiltrationsröhrchen gelöst werden, um die Konzentration zu reduzieren. Letzteres besteht darin, verschiedene Pufferlösungen zu ändern, bis das Protein nicht ausfällt.
(5) Die vorherigen Schritte werden verwendet, um Protein zu konzentrieren. Wenn Sie den Puffer ändern möchten, wenn die gesamte Proteinlösung auf etwa 1 ml konzentriert ist, fügen Sie vorsichtig einen neuen Puffer hinzu (Ultrafiltration durch 0,22 um Ultrafiltrationsmembran) und konzentrieren Sie sich dann dreimal hintereinander auf etwa 1 ml. Das Endvolumen der letzten Konzentration hängt von der erforderlichen Proteinkonzentration ab, die im Allgemeinen nicht mehr als 500 μl beträgt, oder sie kann auf weniger als 200 μl konzentriert werden. Nach der Volumenkonzentration von mindestens 10 mal jedes Mal kann es mehr als 1000 mal dreimal erreichen, was im Grunde den Zweck des Wechsels des Puffers erreichen kann.
