Membrantechnologie und Impfstoffklärung (Ⅰ)

Impfstoffe stammen aus verschiedenen Quellen, darunter Gewebeextrakte, Bakterienzellen, Viruspartikel, Proteine ​​und Nukleinsäuren, die von rekombinanten Säugetierzellen, Hefe- und Insektenzellen produziert werden.

Die gängigste Methode zur Impfstoffherstellung basiert auf einem anfänglichen Fermentationsprozess, gefolgt von einer Reinigung. Die Impfstoffherstellung ist ein komplexer Prozess, der viele verschiedene Schritte und Prozesse umfasst. Die Wahl der richtigen Reinigungsmethode ist entscheidend, um die gewünschte Reinheit des Endprodukts zu erreichen. Die Klärung von Impfstoffen ist ein wichtiger Schritt, der erhebliche Auswirkungen auf die Produktrückgewinnung und die anschließende nachgelagerte Reinigung hat. Zur Klärung von Impfstoffen können verschiedene Techniken verwendet werden. Die Wahl der Sammelmethode und der Ausrüstung hängt vom Batterietyp, der Art des zu sammelnden Produkts und der Prozessflüssigkeit ab. Zu diesen Techniken gehören Membranfiltration (Mikrofiltration, Tangentialflussfiltration), Zentrifugation und Tiefenfiltration (Normalflussfiltration). Aus langjähriger Erfahrung wird die Klärung der Impfstoffernte normalerweise durch Zentrifugation gefolgt von Tiefenfiltration erreicht.

 

In den letzten Jahren haben membranbasierte Techniken bei der Impfstoffklärung an Bedeutung gewonnen. In vorgelagerten Prozessen werden zunehmend Einwegtechnologien eingesetzt, sodass sich die Gewinnungsstrategien ändern müssen. Dieser Artikel bietet einen umfassenden Überblick über verschiedene membranbasierte Technologien und ihre Anwendungen bei der Impfstoffklärung.

 

01 Einleitung

Impfstoffe sind ein entscheidender Bestandteil unserer Prävention von Infektionskrankheiten, die nach wie vor eine erschreckende Todesursache darstellen. Dank Impfungen werden jedes Jahr zwischen 2 und 3 Millionen Menschen vor Diphtherie, Tetanus, Keuchhusten und Masern bewahrt. Impfstoffe decken ein breites Spektrum ab, von kleinen rekombinanten Proteinen bis hin zu ganzen Viruspartikeln und ganzen Bakterien. Sie können von verschiedenen Systemen produziert werden: Eiern, Säugetierzellen, Bakterien usw. Aufgrund der Komplexität und Vielfalt der Impfstoffe gibt es derzeit trotz des wachsenden Interesses an Impfstoffplattformen kein gängiges Reinigungsprotokoll oder -muster.

 

Typischerweise kann ein Impfprozess in drei Teile unterteilt werden: Upstream (Produktion und Klärung), Downstream-Behandlung (Reinigung einschließlich Ultrafiltration, Chromatographie und chemische Behandlung) und Formulierung (Abfüllvorgänge). Unabhängig vom Produktionssystem spielt die Klärung (die anfängliche Entfernung unerwünschter Substanzen) eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung eines robusten Reinigungsprozesses. Ein richtiger Klärungsschritt entfernt hauptsächlich ganze Zellen, Zelltrümmer, Kolloide und große Aggregate, um die Belastung der Downstream-Verarbeitung zu verringern. In einigen Fällen kann die Klärung auch unlösliche Verunreinigungen, Wirtszellproteine ​​(HCP) und Wirtszellnukleinsäuren reduzieren. Wie jeder andere Reinigungsschritt muss der Klärungsschritt optimiert werden, um eine maximale Produktausbeute und Reinheit zu erreichen und gleichzeitig die Spezifität und Produktionsbeschränkungen des Impfstoffs anzupassen.

 

Aufgrund der Heterogenität der Impfstofftypen werden zur Klärung unterschiedliche Techniken eingesetzt, darunter Zentrifugation oder Filtration (Tabelle 1).

 

Um die gewünschte Klärung zu erreichen, sind normalerweise mehrere Arbeitsgänge erforderlich. Der erste Arbeitsgang dient der Entfernung größerer Partikel (Primärklärung) und der zweite Arbeitsgang der Entfernung von Kolloiden und anderen Partikeln mit einer Größe unter einem Mikron (Sekundärklärung). Die Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit dient als einmalige Klärungsoption, bei der Zellen und Zelltrümmer durch Niederschlag entfernt werden. Die Zentrifugation kann hohe Feststoffmengen verarbeiten und wird häufig im Batch- oder kontinuierlichen Modus sowie in Scheibenzentrifugen eingesetzt. Sie erfordert hohe Kapitalinvestitionen und Wartungskosten und ist aufgrund des Fehlens eines zuverlässigen Scale-Down-Modells bei der Skalierung schwierig. Einige kommerzielle Impfstoffhersteller verwenden jedoch Zentrifugen in der Produktion im großen Maßstab, was hohe Verarbeitungsvolumina und mehr Produktionsaktivitäten mit sich bringt.

 

Die Klärfiltration kann durch Normalflussfiltration (NFF, auch bekannt als Dead-End-Filtration) oder Tangentialflussfiltration (TFF, auch bekannt als Cross-Flow-Filtration) durchgeführt werden. Es gibt auch spezielle Filtermodi (Tiefenfilter), die positiv geladene Materialien und Filterhilfsmittel enthalten, die die Rückhaltung von Zelltrümmern, Kolloiden und negativ geladenen unerwünschten Komponenten verbessern.

 

Membranfilter halten Partikel durch Größenausschluss zurück und haben keine hohe Schmutzrückhaltekapazität, sodass sie für sekundäre Klärungsschritte geeignet sind. Sowohl Tiefenfilter als auch Membranfilter sind leicht skalierbar und zu implementieren (einfaches Systemdesign). Im Gegensatz zu NFF wird TFF hauptsächlich zur primären Klärung (Mikrofiltration) verwendet. Membranen mit einem Cut-off-Bereich von 0.1-0.65 μm (vorzugsweise mit offenem Kanal) wurden erfolgreich verwendet, um Zellen, Zelltrümmer und andere große Verunreinigungen zurückzuhalten. Die meisten TFF-Geräte sind linear skalierbar und nach der Reinigung wiederverwendbar, was die Kosten für Verbrauchsmaterialien für den Schritt erheblich senkt.

 

Der Klärungsschritt liegt zwischen den vorgelagerten und nachgelagerten Prozessen und wird bei der Entwicklung von Impfstoffprozessen manchmal übersehen, da Zeit und Ressourcen für andere Reinigungsschritte wie Chromatographie oder Dichtegradientenzentrifugation priorisiert werden.

 

Selbst Patente für Impfstoffherstellungsverfahren lassen den Klärungsschritt oft aus. Die Klärungseffizienz wirkt sich direkt auf die Leistung des nachgelagerten Prozesses aus. Ein schlecht optimierter Klärungsschritt kann sich negativ auf die Kapazität des sterilisierten Filters auswirken oder die Lebensdauer des chromatographischen Harzes verkürzen. Heutzutage tendieren strengere regulatorische Erwartungen dazu, dass Impfstoffhersteller reinere, gut charakterisierte, aber erschwingliche Impfstoffe produzieren. In diesem Fall muss jedem Schritt die Aufmerksamkeit gewidmet werden, die er verdient. Aktuelle Trends deuten darauf hin, dass sich der vorgelagerte Prozess in Richtung eines „saubereren“ Expressionssystems (d. h. in serumfreiem Medium kultivierte Zellen ersetzen Eier) mit erhöhter Produktivität und höherer Zelldichte bewegt.

 

Um die Reinheit des Endprodukts zu erhöhen, werden nachgelagerte Reinigungsprozesse vereinfacht und rationalisiert. Um diese Änderungen zu bewältigen, darf der Klärungsschritt nicht zum Engpass werden. In diesem Fall begegnet die Filtrationstechnologie einer neuen Klärungsherausforderung und befasst sich mit den Themen erhöhte Prozessflexibilität, Möglichkeit der Einmalverwendung und reduzierte Investitionskosten.

 

02 Klärung von Virusimpfstoffen

Zur Klärung der Ernte am Zufuhrende von Impfstoffen wurden verschiedene Klärverfahren entweder allein oder in Kombination erfolgreich eingesetzt.

Pilotmaßstab: 1-20 L, Produktionsmaßstab: mehr als 20 L

 

2.1 Vorsichtsmaßnahmen bei der Aufklärung des Virusimpfstoffs

Viele Impfstoffe enthalten alle oder einen Teil der Viruspartikel, um Immunität gegen eine Virusinfektion zu erzeugen. Sie werden im Allgemeinen in vier große Kategorien eingeteilt:

Lebendimpfstoff (LAV), der auf einem abgeschwächten Stamm des Virus basiert, um dessen Virulenz zu verringern. Abgeschwächte Viren können sich im Körper vermehren, sind aber nicht pathogen.

- Inaktivierte Virusimpfstoffe (IV), die chemisch oder durch Ultraviolettstrahlung inaktivierte Viren enthalten, um die Infektiosität zu eliminieren. Viruspartikel können vollständig, geteilt oder gereinigt sein (nur antigene Proteine).

- Der virale Vektorimpfstoff (VV) ist ein aktives, nicht pathogenes Virus, das das Antigen eines pathogenen Virus präsentiert. Diese neu entwickelten Strukturen werden auch für gentherapeutische Anwendungen eingesetzt.

Impfstoffe mit virusähnlichen Partikeln (VLPs), eine spezielle Klasse viraler Untereinheitenimpfstoffe, die die Gesamtstruktur viraler Partikel nachahmen, jedoch kein infektiöses genetisches Material enthalten.

 

In den meisten Fällen bleiben die Viruspartikel während des Klärungsschritts vollständig intakt, sogar während der Lyse des Virusimpfstoffs (die Spaltung wird normalerweise später in einer reineren Umgebung durchgeführt).

Die größte Herausforderung bei der Virusklärung ist die Rückgewinnung von Viruspartikeln mit hoher Ausbeute bei gleichzeitiger effizienter Entfernung von Zelltrümmern, großen Aggregaten und unlöslichen Verunreinigungen. Wie in den folgenden Abschnitten beschrieben, gibt es mehrere Faktoren, die zu Virusabbau oder -verlust führen können. Darüber hinaus kann die Virusausbeute aufgrund der hohen Variabilität der quantitativen Virustestmethoden in dieser Phase des Prozesses, insbesondere bei LAV- und VV-Impfstoffen, schwer verlässlich sein. Bei diesen Impfstoffen wird die Virusausbeute häufig mithilfe von Infektiositätstests wie dem Plaque-Test oder dem TCID 50-Test bewertet. Die Tatsache, dass einige der geernteten Verbindungen die Fähigkeit des Virus beeinträchtigen können, Indikatorzellen zu infizieren, erhöht die Variabilität dieses quantitativen Ansatzes.

 

2.2 Strategie zur Aufklärung des Virusimpfstoffs

Virale Impfstoffe unterscheiden sich erheblich in Größe, Struktur, Form und Expressionssystemen (Tabelle 3).

Daher gibt es im Allgemeinen keine Vorlage für die nachfolgenden Prozesse, insbesondere die Klärungsschritte. Theoretisch können alle verfügbaren Techniken (Low-Speed-Zentrifugation, Mikrofiltration TFF, NFF) ausgewählt und möglicherweise kombiniert werden, um das Virus zu klären. Tatsächlich wird der Erfolg der Klärungsmethoden vom Expressionssystem und den physikochemischen Eigenschaften der beteiligten Viren beeinflusst.

 

Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} Zellen/ml) Klärungsmethode unter Verwendung kationischer Polymere reduzierte die Tiefenfiltrationsfläche im Vergleich zu herkömmlichen Methoden um das Vierfache. Diese Technik ermöglicht die Ernte von Fermentern mit großer Kapazität ohne den Einsatz von Zentrifugen. Ebenso zeigten Riske et al., dass die Chitosanbehandlung von 40 l Zellkulturen (0,02 %) mit 1,4-2,6 % Feststoffen zu einer 7-fachen Erhöhung der absoluten Filterkapazität nach der Tiefenfiltration führte.

 

Sie erwähnen auch, dass Chitosan die Klärungseffizienz durch Ausflocken von Submikronpartikeln zu verbessern scheint, die sich normalerweise in Zentrifugen absetzen. Vorbehandlungs- und Flockungsmethoden werden wahrscheinlich auch weiterhin Teil der zukünftigen Impfstofffiltrationsklärung sein. Penetrantien, einschließlich Zucker, Glykole und Aminosäuren, flocken bevorzugt Viren aus. Die Virusflockung mit osmotischer Lösung, gefolgt von 0,2µ Mikrofiltration, kann als umfassender Prozess zur Virusreinigung verwendet werden. Penetrantien können die Virusaggregation stimulieren, indem sie die Hydratationsschicht um die Partikel reduzieren, um hydrophobe nicht eingekapselte Viruspartikel und eingekapselte Viruspartikel auszuflocken. Obwohl gezeigt wurde, dass Penetrantien Viren ausflocken, hat die Methode das Potenzial, eine Plattform für die zukünftige Impfstoffreinigung zu sein, und ihre Durchführbarkeit in Pilot- oder groß angelegten Impfstoffreinigungen wurde nicht nachgewiesen. Die Flockungsvorbehandlungsmethode, die wahrscheinlich auch weiterhin Teil der zukünftigen Impfstofffilterklärung sein wird, wird in einem 2-Liter-Fermenter durchgeführt. Um potenziell in großtechnischen Produktionsabläufen eingesetzt werden zu können, müssen diese Methoden im Pilot- und Produktionsmaßstab validiert werden.

 

2.2.1 Darstellung der Systemauswirkungen

Die Klärungsmethode hängt hauptsächlich von der Art des vorgelagerten Prozesses und des Expressionssystems ab, das die Art und Menge der zu entfernenden Verunreinigungen bestimmt. Virale Impfstoffe werden normalerweise in Hühnerembryonen durch kontinuierliche Zelllinien von Säugetieren oder Vögeln oder Baculovirus-/Insektenzellen produziert, die ein komplexeres Expressionssystem darstellen. Einige Arten von VLPs können auch durch andere heterologe Expressionssysteme (Bakterien, Hefe, Pflanzenzellen) produziert werden.

 

2.2.1.1 Im Hühnerembryo produziertes Virus

Impfstoffe werden seit Jahrzehnten in Eiern hergestellt. Diese Arbeit geht auf das Jahr 1931 zurück, als Woodruff und Good Pasture die Chorioallantoismembran befruchteter Eier erfolgreich als Substrat für das Viruswachstum nutzten. Noch heute werden viele Impfstoffe für Menschen und Tiere nach diesem alten Verfahren hergestellt. Der bekannteste ist wahrscheinlich der saisonale Grippeimpfstoff. Das Prinzip besteht darin, Hühnereier mit den gewünschten Viren zu impfen und sie dann in der Chorioallantoismembran zu vermehren. Nach der Vermehrung wird die an Viruspartikeln reiche Allantoisflüssigkeit gesammelt und gereinigt.

 

Allantoisflüssigkeit ist ein anspruchsvolles Klärfutter. Ihr hoher Mineral- und Proteingehalt (einschließlich Ovalbumin) verleiht ihr eine hohe Viskosität. Allantoisflüssigkeit enthält auch wichtige Gewebebestandteile von Hühnerembryonen wie Federn, Schnäbel, Blutgefäße oder Blutzellen. Aufgrund des hohen Feststoffgehalts ist die Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit die bevorzugte Option für die Primärklärung, was in der Regel zu einer Rückgewinnungsrate von etwa 70 % führt. Eine Primärklärung mithilfe von Filtrationstechniken ist jedoch ebenfalls möglich. Für NFF bieten Tiefenfilter auf Polypropylen- und Zellulosebasis gute Möglichkeiten zum Sammeln von Allantoisflüssigkeit. Oberflächenfilter aus Tiefenfiltern auf Polypropylen- oder Zellulosebasis können eine Kapazität von 150-210 l/m² aufweisen und die Trübung des Futterflusses um bis zu das Dreifache reduzieren. Das TFF-Gerät mit offenem Futterkanal ist auch für die Klärung von Allantoisflüssigkeit geeignet, da das Gerät besser für einen minimalen Druckverlust durch den Futterkanal geeignet ist und somit Kanalverstopfungen reduziert.

 

Der sekundäre Klärungsschritt kann problemlos mit NFF durchgeführt werden. Eine Kombination aus Polypropylen-, Zellulose- und Glasfasermaterialien zeigt im Allgemeinen eine gute Effizienz, und eine Alternative zum sekundären Klärungsschritt besteht darin, TFF und ein {{0}},65 μm- oder 0,45 μm-Mikrofiltrationsmembrangerät zu verwenden und eine osmotische Flusskontrolle durchzuführen. In diesem Schritt kann ein TFF-Gerät mit offenem Kanal und einer hydrophilen PVDF- oder einer hydrophilen PES-Membran verwendet werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass Viruspartikel mit unlöslichem Trümmermaterial verbunden sein können, was die Virusproduktion während der Klärung erheblich reduzieren kann. Die Verwendung einer Salzlösung kann diese Verbindung zwischen Grippeviren und festen Fragmenten reduzieren, was zu einer etwa zweifachen Produktionssteigerung führt, ohne die Integrität der Viruspartikel zu beeinträchtigen.

 

2.2.1.2 In aufeinanderfolgenden Säugetier- und Vogelzelllinien produzierte Viren

In jüngster Zeit hat man sich bei einigen Virusimpfstoffen von eibasierten Verfahren abgewandt und stattdessen auf Zellkulturen basierende Verfahren eingesetzt (insbesondere bei Grippeimpfstoffen). Der Hauptgrund für diesen Wechsel ist die Vermeidung von Problemen bei der Impfstoffproduktion im Zusammenhang mit embryonalen Eiern (d. h. einem Mangel an Eiern, der im Falle eines Ausbruchs einer Geflügelkrankheit auftreten kann). Daher werden derzeit viele Arten von Impfstoffen und Virusvektoren unter Verwendung kontinuierlicher Zelllinien von Säugetieren oder Vögeln, konventioneller Zelllinien (wie Vero-, MDCK- oder HEK293-Zelllinien) oder proprietärer Zelllinien entwickelt.

 

Je nach Expressionssystem kann das Virus in der Zelle verbleiben, was einen Zelllyseschritt erfordert, oder es kann außerhalb der Zelle verbleiben (Lyse oder Knospenbildung). Die aus der Zellkultur gewonnene Feststoffbeladung und der lösliche Inhalt sind viel sauberer als die allantoisische Flüssigphase. Daher ist die NFF-Technologie einfacher zu implementieren und die Kapazität ist deutlich höher. Die Filtrationskapazität hängt jedoch stark von den Zellkulturbedingungen ab, wie etwa der Zelldichte oder der Zelllebensfähigkeit bei der Ernte. Diese Parameter beeinflussen die Menge an Zelltrümmern und Makroaggregaten, die Tiefenfilter und Membranen verstopfen können, was zu einer verringerten Kapazität führt.

 

Thomassen et al. liefern ein gutes Beispiel für die NFF-Klärung. Wird im Produktionsprozess von inaktiviertem Poliovirus (IPV) verwendet. Auf Mikroträgern kultivierte Vero-Zellen wurden zur Virusvermehrung mit einer Zelldichte von {{0}},78 x 106 Zellen/ml TOI verwendet. Zur Vorklärung wird ein 75-μm-Edelstahlsieb verwendet, um Mikroträger aus der Ernte zu entfernen. Die Doppelschicht-Klassifizierung wird mithilfe eines Dichtetiefenfilters (0,2-2,0 μm) geklärt, gefolgt von einem Sterilfilter.

Die ausgewählte skalierbare Einwegeinheit wurde erfolgreich für die Vorbereitung von Sabin IPV-Klinikversuchsmaterial im 350-l-Maßstab verwendet. Je nach Virusserotyp wird eine Virusrückgewinnungsrate von 86 bis 96 Prozent erreicht.

 

2.2.1.3 Im Insektenzellsystem produzierte Baculoviren/virusähnliche Partikel

Die Verwendung von Baculovirus/Insektenzellsystemen für die Impfstoffproduktion im großen Maßstab ist relativ neu, stößt aber auf dem Gebiet viraler Vektoren und VLPs auf zunehmendes Interesse. Der Hauptvorteil dieses Systems besteht in seiner kurzlebigen (keine Notwendigkeit, Zelllinien zu etablieren) und sicheren (keine vollständige Virus-DNA) Produktion. Es gibt jedoch auch einige Nachteile, wie die Notwendigkeit der Baculovirus-Entfernung und die Produktstabilität.

 

Cervarix, ein von GlaxoSmithKline hergestellter VLP-Impfstoff gegen Infektionen mit humanen Papillomaviren, ist der erste kommerziell in Insektenzellen produzierte Impfstoff für Menschen. Eine Reihe von Impfstoffen auf Basis von VLPs und rAAV-Vektoren, die in mit Baculoviren infizierten Insektenzellen produziert werden, befinden sich derzeit in der Entwicklung. Insektenzelllinien, die aus dem Herbst-Heerwurm Spodoptera frugiperda (Sf9 und Sf21) und dem Kohlgewächs Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4-Zellen) gewonnen wurden, werden am häufigsten verwendet, da sie in Suspension wachsen können, was die Amplifikation des vorgelagerten Prozesses vereinfacht. Nachdem diese Zellen bis zur gewünschten Dichte lebender Zellen gewachsen sind, werden sie in der exponentiellen Zellwachstumsphase zur Proteinexpression mit rekombinantem Baculovirus infiziert. Das große Genom der Baculoviren ermöglicht die Expression von fünf oder mehr verschiedenen Proteinen, was der Komplexität von VLP und viralen Vektoren entspricht.

 

Bernard et al. beschrieben den Downstream-Prozess der Insektenzellkultur. Der Prozess ist sehr variabel, was die Vielfalt der mit dieser Technik produzierten Proteine ​​widerspiegelt. Der erste Schritt der Reinigungssequenz wird stark von den Volumeneigenschaften des Bioreaktors (d. h. Zelldichte und Lebensfähigkeit) oder von der Art der Produktfreisetzung (abgesondert durch Knospenbildung oder Zelllyse) beeinflusst. Eine Infektion von Insektenzellen mit Baculovirus kann innerhalb von 3-5 Tagen zur Zelllyse führen. Die Zerstörung der Zellen kann zu einer Zunahme der proteolytischen Aktivität und anderer Umweltfaktoren führen, die zum Abbau rekombinanter Proteine ​​führen können.

Es gab Versuche, Baculoviren mit einer geringeren Fähigkeit zur Einleitung der Zelllyse zu entwickeln. Das Baculovirus lysiert weniger als 10 Prozent der infizierten Insekten.

 

Die Zelllyse kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wie etwa Einfrieren-Auftauen, Detergenzien, Homogenisatoren oder Ultraschallbehandlung. Insektenzellen haben keine Zellwand und lösen sich daher schnell auf. Obwohl Ultraschallbehandlung in vielen Laborprozessen berichtet wurde, wird sie selten in experimentellem oder kommerziellem Maßstab eingesetzt. Die gebräuchlichste Methode ist die Verwendung eines Homogenisators, um Zellen in Gegenwart eines Detergens in niedriger Konzentration (0,1 % Triton X-100 oder NP-40) zu zerstören. Die Verwendung von Detergenzien und Mikrofluidisierung oder osmotische Stoßhomogenisierung wurde in vielen groß angelegten Herstellungsprozessen erfolgreich eingesetzt. Typischerweise werden Insektenzellen in Lysepuffern (50 mM TRIS pH 7,7, 300 mM NaCl, 5 % Glycerin, 0,2 mM PMSF und Proteaseinhibitoren) suspendiert, wobei Triton-X100 bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % hinzugefügt wird, gefolgt von milder Ultraschallbehandlung oder Mikrofluidisierung. Anschließend wird die Mischung zentrifugiert, um unlösliche Partikel zu entfernen.

 

In diesem Stadium kann das Lysat sehr trüb erscheinen und lässt sich mit einem 0,45-μm-Filter nur schwer filtern. Während des Pyrolyse-Klärungsschritts können manchmal Verluste von bis zu 30 % beobachtet werden. Die Zugabe von Benzoenzymen im Spaltungsstadium hilft, das Filtrationsproblem zu lösen. Das Reinigen der Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung nach der Ernte und schnelles „Gefrieren und Auftauen“ in einer salzreichen (500 mM NaCl) Lösung, die den Cracking-Puffer enthält, hilft, die Aggregate zu entfernen.

 

Die Klärung von VLPs und viralen Vektoren, die von Insektenzellen produziert werden, erfolgt nach der Zelllyse (durch chemische oder mechanische Behandlung), bei der nicht nur virale Partikel, sondern auch große Mengen zellulärer Nukleinsäure freigesetzt werden. Insektenzellen können mit einer hohen Zelldichte von 1-9.10 6 Zellen/ml wachsen. Daher sollte der Klärungsschritt eine hohe Zelldichte, einen hohen Nukleinsäuregehalt und, wenn möglich, die Entfernung von Baculoviruspartikeln umfassen. Um die Sache noch komplizierter zu machen, können VLPs oder virale Vektoren und Baculoviren ähnliche Größen aufweisen (Baculoviren sind 60-80 Nanometer breit und 300-400 Nanometer lang). Aufgrund der hohen Zelldichte war Zentrifugation jahrzehntelang die bevorzugte Technik zur primären Klärung. Membranverfahren scheinen jedoch eine sehr attraktive Alternative zu sein, da die Skalierbarkeit leicht zu definieren ist.

 

Tiefenfilter wurden im Downstream-Prozess dreischichtiger rotavirusähnlicher Partikel erfolgreich eingesetzt. Auf Laborebene wird häufig die CsCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsmethode verwendet, um diese komplexen Partikel zu reinigen. Die Forscher bewerteten nicht nur den Klärungsschritt des Tiefenfilters, sondern auch den gesamten Downstream-Prozess (Triton X-100-Spaltung und Tiefenfiltration, gefolgt von Ultrafiltration und Partikelgrößenausschluss). Die Ergebnisse zeigen, dass die Ausbeute des CsCl-Dichtegradienten 37 % erreichen kann.

Die Ultrazentrifugenmethode beträgt etwa 10 %. In einem weiteren Beispiel wurden 0,45 μm Hohlfasern und 500 kDa Feindurchmesserfasern verwendet, um HIV-ähnliche Partikel, die in Insektenzellen produziert werden, zu gewinnen und zu konzentrieren. In dieser Studie wurde die Scherkraft der Hohlfasern basierend auf der Zellintegrität optimiert. Ergebnisse: Ein Verfahren mit geringer Scherkraft wurde etabliert, um die Gradienten-Ultrazentrifugation mit Haushaltszucker zu ersetzen.

 

Das Verfahren hat das Potenzial, in der Massenproduktion eingesetzt zu werden. Tiefenfilter wurden auch erfolgreich bei der Herstellung rekombinanter Adeno-assoziierter Viren eingesetzt. Die Zelllyse wurde mit einem mechanischen Zweikolben-Zellstörer durchgeführt, gefolgt von einer Nukleasebehandlung. Im Klärungsschritt wurde ein 1,2 μm Glasfaser-Tiefenfilterelement verwendet, gefolgt von zwei Schichten 0,8 μm hydrophilem PES und 0,2 μm hydrophilem PES. Proportional dimensionierte Filter werden für Prozesschargen von kleineren bis zu 200 L-Größen verwendet. Tiefenfilter wurden erfolgreich eingesetzt, und TFF-Bewertungen mit Flachfolien oder Hohlfasern von 0,2 μm oder 0,45 μm wurden ebenfalls als sehr effektiv beschrieben.

 

Die Studie von Tecnologica (IBET) am Oeiras Institute of Experimental Biology in Portugal verwendete NFF, um eine Klärung von Hepatitis C VLP durchzuführen, das von Baculoviren exprimiert wird, ohne Zentrifugation. Nominell bewertete Polypropylenfilter (10,5,0,6 und 0,3μm) werden verwendet, um die VLP-Ernte zu klären. Dieselben Filter mit Porengrößen von 0,6μm und 0,3μm werden zur Filtration in VLP-Erntezentren verwendet. Alle untersuchten Filtrate wurden auf HCV-VLP-Rückgewinnungsraten getestet und die empfohlenen Filtrationsmethoden wurden verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Die Ergebnisse zeigten, dass der 5-μm-Filter (1,3 μm) die höchste Produktrückgewinnung (1,4 μm) für direkt geerntetes Hepatitis C-VLP-Futter aufwies. Der 0,6-μm-Polypropylenfilter hatte die höchste Produktrückgewinnung (82 %) für das zentrale Futter, und die DNA-Clearance der Wirtszelle betrug etwa 70 %.

 

2.2.1.4 Virusähnliche Partikel, die in Bakterien- oder Hefesystemen produziert werden

Die Art der Klärungsmethode für VLP-Impfstoffe, die in Bakterien- oder Hefesystemen exprimiert werden, hängt von der Freisetzung von VLP an extrazelluläre Mediatoren ab. Wenn VLPs nicht effizient sezerniert werden können, können vor dem eigentlichen Klärungsschritt Zelllyse oder andere Extraktionsschritte erforderlich sein. Während dies der Goldstandard in der Proteinklärungsbranche ist, sind Zentrifugation (kontinuierlich oder Batch) in bakteriellen oder hefebasierten Systemen, in jüngerer Zeit jedoch Membranverfahren aufgrund ihrer einfachen Skalierbarkeit und Kompatibilität mit Einwegbehandlungen eine sehr attraktive Alternative geworden.

 

Richter und Topell erläutern die Verwendung von Zentrifugation, TFF oder einer Kombination aus beidem bei der Herstellung von VLPs, die in geklärten E. coli hergestellt werden. In ihrer Arbeit wurden 0,45 m TFF-Membranen verwendet, um die homogenisierten E. coli-Homogenate bei einer Temperatur von 5 Grad zu verdünnen und zu klären. Sie weisen auch darauf hin, dass membranbasiertes TFF für die Handhabung von Ernten mit hoher Viskosität geeignet ist, vorzugsweise unter Verwendung von TFF-Einheiten mit offenen Kanalkonfigurationen.

Auch die Zentrifugalklärung wurde als Alternative zu TFF untersucht. In diesem Fall wurde das resultierende Homogenat nicht verdünnt und 105 Minuten lang bei 4 Grad zentrifugiert, 10000 g. Ohne die weiche Beschichtung zu übertragen, wurde der Überstand von den Partikeln abgegossen und erneut 60 Minuten lang bei 4 Grad und 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dann von den vorhandenen Partikeln entfernt, mit EB-Puffer (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris-Base, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 verdünnt und auf einem 0,22 m Sterilfiltergerät gefiltert. Weitere Verarbeitung. Der Scale-up-Prozess für die Produktion dieses VLP-Impfstoffs in E. coli im 800-Liter-Maßstab wurde Berichten zufolge auch durch die Kombination von Zentrifugation und TFF vereinfacht.

 

Der rekombinante Hepatitis-E-Impfstoff HEV 239 wurde in China für die Immunisierung von Erwachsenen ab 16 Jahren zugelassen. Impfstoffantigene (VLP) werden in E. coli exprimiert, und der Antigenproduktionsprozess kann nachweislich auf einen 5-Liter-Maßstab hochskaliert werden. Das Produkt wurde durch Aufbrechen von E. coli extrahiert, und die Einschlusskörper wurden durch gründliches Waschen mit einem Puffer, der 2 % Triton X enthielt, von den Zellfragmenten getrennt und dann mit einem 4 M Harnstoffhomogenisator aufgelöst. TFF klärt humanes Papillomavirus-VLP, das in Saccharomyces cerevisiae (15 l) produziert wurde. Das mit Nuklease behandelte Zelllysat wurde durch Crossflow-Mikrofiltration im Transfiltrationsmodus unter Verwendung eines 0,65 μm Hohlfaserfilters geklärt. Das gleiche Verfahren wird bei der Impfstoffproduktion verwendet. Obwohl bisher nur eine Handvoll VLP-basierter Impfstoffe die kommerzielle Nutzung erreicht haben, befinden sich mehrere VLP-basierte Impfstoffe in der Entwicklung, von denen die meisten mittels Zentrifugation oder Membrantechnologie geklärt werden.

 

Aufgrund räumlicher Einschränkungen werden wir die zweite Hälfte des Inhalts im nächsten Kapitel teilen. Im nächsten Artikel werden wir einige Fälle der Impfstoffklärung und der Verwendung relevanter Membrankomponenten teilen.

 

Als erstes Unternehmen im Lokalisierungskreislauf hat Guidling Technology ausreichend relevante Erfahrung in der Impfstoffklärung gesammelt. Guidling Technology ist ein Entwicklungs- und Produktionsunternehmen mit Schwerpunkt auf Biopharmazeutika und Zellkulturen, Reinigung und Trennung. Die Produkte werden häufig in der Biomedizin, Diagnose, industriellen Flüssigkeitsfiltration, Erkennung, Klärung, Reinigung und Konzentration eingesetzt. Guidling hat erfolgreich Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen, Ultrafiltrations-/Mikrofiltrationsmembrankassetten, Virenentfernungsfilter, Tangentialflussfiltergeräte, tiefe Membranstapel usw. entwickelt, die die Anwendungsszenarien der Biopharmazeutika und Zellkulturen vollständig erfüllen.

 

Unsere Membranen und Membranfilter werden häufig zur Konzentration, Extraktion und Trennung von Vorfiltration, Mikrofiltration, Ultrafiltration und Nanofiltration eingesetzt. Unsere breite Produktpalette, von kleinen Einweg-Laborfiltrationen bis hin zu Produktionsfiltrationssystemen, Sterilitätstests, Fermentationen, Zellkulturen und mehr, kann die Anforderungen von Tests und Produktion erfüllen.