Vollständige Analyse des MRNA-Arzneimittelherstellungsprozesses: Wie die TFF-Technologie Reinigungsprobleme löst
In den letzten Jahren hat die mRNA-Technologie bahnbrechende Fortschritte im biopharmazeutischen Bereich erzielt und ein enormes Anwendungspotenzial gezeigt, insbesondere bei Impfstoffen und Gentherapie. Die erfolgreiche Entwicklung von mRNA-Impfstoffen hat nicht nur neue Lösungen für die Prävention und Kontrolle von Infektionskrankheiten hervorgebracht, sondern auch Fortschritte in der Krebsimmuntherapie und der personalisierten Medizin vorangetrieben. Da es sich um eine neuartige Klasse von therapeutischen Produkten handelt, stellt die Herstellung von mRNA im großen Maßstab eine große Herausforderung dar. Dazu gehören die Kontrolle der RNA-Stabilität, die Entfernung restlicher Enzyme und Reaktionsnebenprodukte, der Pufferaustausch und die Erzielung hoher Reinheitsrückgewinnungsraten. All dies erfordert Herstellungstechnologien mit behördlich zugelassenen Lösungen.
Der Herstellungsprozess von mRNA-Impfstoffen oder -Therapeutika gliedert sich hauptsächlich in drei Phasen: Herstellung einer Plasmid-DNA-Massenlösung, Herstellung einer mRNA-Massenlösung und Herstellung eines mRNA-LNP-Arzneimittelprodukts.
Flussdiagramm des mRNA-Arzneimittelherstellungsprozesses
Die Tangentialflussfiltration (TFF) ist eine bewährte Membrantrenntechnologie und wird aufgrund ihrer hocheffizienten Molekularsiebfähigkeit, des kontrollierbaren Pufferaustauschs und der geringen Scherspannung häufig in der mRNA-Herstellung eingesetzt. Basierend auf dem Membranmoduldesign umfassen gängige TFF-Konfigurationen flache -Blattkassetten und Hohlfasermodule. Darüber hinaus kann die druckgetriebene Membrantrennung in TFF entsprechend der Membranporengröße in Mikrofiltration (MF), Ultrafiltration (UF), Nanofiltration (NF) und Umkehrosmose (RO) mit zunehmend zunehmender Selektivität eingeteilt werden.
TFF spielt in mehreren Phasen der mRNA-Arzneimittelherstellung eine entscheidende Rolle, einschließlich der Vorbereitung der Plasmid-DNA-Masse, der mRNA-Massenproduktion und der endgültigen Formulierung von mRNA-LNP-Arzneimitteln. Durch die entsprechende Auswahl des Membrantyps, der Molekulargewichtsgrenze (MWCO) und des Membranmaterials ermöglicht TFF eine effiziente Entfernung von Reaktionsnebenprodukten und Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht und erleichtert gleichzeitig den Pufferaustausch und die Konzentration sowohl vor als auch nach der LNP-Einkapselung. Dies verbessert die Reinheit, Stabilität und Skalierbarkeit des gesamten Prozesses erheblich.
Darüber hinaus wird die Leistung der Tangentialflussfiltration durch Systemkonfigurationsfaktoren wie Pumpentyp und Schlauchdesign sowie durch wichtige Prozessparameter wie Transmembrandruck (TMP), Scherspannung und Filtrationsfluss beeinflusst. Diese Faktoren müssen sorgfältig ausgewählt und auf der Grundlage der Eigenschaften des Zielprodukts optimiert werden, insbesondere bei stressempfindlichen Produkten wie mRNA-LNP, die während der Verarbeitung sehr anfällig für äußere mechanische Kräfte sind.
Reinigung von Plasmid-DNA
Die Herstellung der Plasmid-DNA-Stammlösung basiert grundsätzlich auf dem Sequenzdesign der Transkriptionsvorlage. Die Herstellungsmethoden umfassen typischerweise die Plasmid-DNA-Amplifikation, obwohl auch die PCR-Amplifikation eingesetzt werden kann. Nehmen wir als Beispiel die DNA-Amplifikation, manipuliertE. coliwird üblicherweise für die fermentative-basierte Amplifikation verwendet. Der nachgelagerte Reinigungsprozess umfasst hauptsächlich Zellsammlung, Lyse und Klärung, Konzentration und Pufferaustausch, Sterilfiltration, Linearisierung und chromatographische Reinigung. In industriellen Umgebungen wird zur Zellsammlung häufig die kontinuierliche Durchflusszentrifugation eingesetzt, die jedoch relativ hohe Scherkräfte erzeugt. Hohlfasersysteme mit ihren offenen Kanälen und geringer Scherung eignen sich besser für die Handhabung von Proben mit hohem Feststoffgehalt, hoher Viskosität oder Scherempfindlichkeit, wie z. B. Plasmid-DNA. Nach der Entnahme werden die Zellen einer Hochdruckhomogenisierung, Ultraschallbehandlung oder alkalischen Lyse unterzogen, gefolgt von einer Vorklärung durch Tiefenfiltration.
Um die anschließende Chromatographie zu erleichtern, wird zur Konzentration und zum Pufferaustausch häufig zunächst eine Tangentialflussfiltration (TFF) unter Verwendung von Membrankassetten oder Hohlfasersäulen mit Molekulargewichtsgrenzen von 30 kDa, 100 kDa oder 300 kDa eingesetzt. Dadurch wird das Probenvolumen reduziert und gleichzeitig einige Verunreinigungen wie RNA, Wirtszellproteine (HCP) und Wirtszell-DNA-Fragmente (HCD) entfernt. Als zentraler Reinigungsschritt dient die Chromatographie. Typischerweise wird die Anionenaustauschchromatographie (AEX) mit der hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) kombiniert, um Verunreinigungen effizient zu entfernen und hoch bioaktive superspiralisierte Plasmid-DNA anzureichern, wodurch die Plasmidreinheit deutlich verbessert wird.
Nach der Reinigung wird das Plasmid erneut TFF unterzogen, um die Lösung auf die Zielkonzentration (normalerweise 0,5–2 mg/ml) zu konzentrieren und eine Dialyse mit dem endgültigen Lagerpuffer durchzuführen. Dieser Schritt entfernt restliche Salze und organische Lösungsmittel aus dem Prozess und stellt sicher, dass das Puffersystem die Anforderungen für nachgeschaltete In-vitro-Transkriptionsreaktionen (IVT) erfüllt.
Reinigung von in vitro transkribierter (IVT) mRNA
In-vitro-Transkription (IVT) und Modifikation sind die Schlüsselprozesse für die Herstellung von mRNA-Stammlösungen. Bei der IVT-mRNA-Produktion wird eine Kombination aus Tangentialflussfiltration (TFF1) – Chromatographie – Tangentialflussfiltration (TFF2) eingesetzt. Diese Strategie gewährleistet eine effiziente und qualitativ hochwertige Reinigung von mRNA und bietet eine entscheidende Unterstützung für die Impfstoffherstellung.
Nachdem die Transkriptions- und Modifikationsreaktionen abgeschlossen sind, wird typischerweise zuerst eine Ultrafiltration/Diafiltration unter Verwendung von Membrankassetten oder Hohlfasersäulen mit Molekulargewichtsgrenzen von 30 kDa, 100 kDa oder 300 kDa durchgeführt. Dieser Schritt entfernt effektiv verschiedene prozessbedingte Verunreinigungen aus dem Reaktionssystem, wie z. B. RNA-Polymerase, restliche DNA-Fragmente, nicht umgesetzte NTPs, Capping-Enzyme, doppelsträngige RNA (dsRNA) und Inhibitoren kleiner Moleküle, während gleichzeitig ein Pufferaustausch erreicht wird. Nach einem einzigen Tangentialflussfiltrationsschritt werden die meisten Verunreinigungen effektiv entfernt und die einzige nachweisbare verbleibende Proteinverunreinigung ist RNA-Polymerase.
Anschließend werden mehrere Chromatographietechniken zur weiteren Reinigung angewendet. Zu den häufig verwendeten Methoden gehören Affinitätschromatographie, Größen--Ausschlusschromatographie, Ionen-paar-Umkehr-phasenchromatographie und Ionen-austauschchromatographie. Durch diese Kombination aus Ultrafiltration und sequenzieller Chromatographie erreicht die mRNA einen hohen Reinheitsgrad.
Um Formulierungs- oder Lagerungsanforderungen zu erfüllen, wird die mRNA-Stammlösung erneut konzentriert oder mit 30-kDa-, 100-kDa- oder 300-kDa-Membrankassetten oder Hohlfasersäulen verdünnt, um die Zielkonzentration genau einzustellen und in den endgültigen Formulierungspuffer auszutauschen. Abschließend wird eine Sterilfiltration durchgeführt, um die mikrobielle Belastung zu kontrollieren und die Zwischenlagerung und Abfüllung des Materials abzuschließen.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Reinigung von mRNA-LNP-Formulierungen
Lipid-Nanopartikel (LNPs) sind derzeit das am umfassendsten untersuchte Abgabesystem für mRNA-Therapeutika. Derzeit befinden sich verschiedene mRNA-LNP-Formulierungen in unterschiedlichen Stadien der präklinischen und klinischen Entwicklung. LNPs reagieren sehr empfindlich auf Herstellungsprozesse. Unter den für die mRNA-LNP-Produktion erforderlichen Einheitsoperationen stellen die Konzentration und der Pufferaustausch mittels Tangentialflussfiltration (TFF) sowie Sterilfiltration erhebliche Herausforderungen dar. Diese Schritte müssen sorgfältig optimiert werden, um die Skalierbarkeit des Prozesses und die Produktqualität sicherzustellen und gleichzeitig Probleme wie Membranverschmutzung und falsche Filterbeladung zu vermeiden.
Nach der mRNA-Verkapselung wird zur Reinigung eine Tangentialflussfiltration (TFF) eingesetzt. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, nicht eingekapselte mRNA, freie Polymere oder Lipidmaterialien sowie restliche Lösungsmittel aus mRNA und Lipiden zu entfernen. Da mRNA-LNPs bei Raumtemperatur eine begrenzte Stabilität aufweisen, ist die Optimierung nachgelagerter Prozesse, einschließlich TFF, von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Produktqualität.
Zu den wichtigsten Optimierungsrichtungen gehören: geeignete Einstellung des Transmembrandrucks (TMP) und der tangentialen Flussrate basierend auf der Partikelgröße und Stabilität von mRNA-LNPs, um Filtrationseffizienz und Partikelstress auszugleichen; Auswahl von Membranen oder Hohlfasersäulen mit geeigneten Molekulargewichtsgrenzen (MWCO, z. B. 100 kDa oder 300 kDa), um freie mRNA, Verunreinigungen und Austauschpuffer effizient zu entfernen und gleichzeitig die Partikeladsorption oder -schädigung zu minimieren; und Optimierung der Konzentration und der Diafiltrationsvolumina, um einen effektiven Pufferaustausch in die Zielformulierung sicherzustellen und die endgültige Partikelkonzentration und -dispersität zu kontrollieren.
Darüber hinaus müssen kritische Qualitätsattribute (wie Partikelgröße, Polydispersitätsindex [PDI] und mRNA-Verkapselungseffizienz) während des Prozesses genau überwacht und Parameter auf der Grundlage von Echtzeitdaten dynamisch angepasst werden, um eine stabile, skalierbare und effiziente Reinigung und Formulierung von mRNA-LNPs zu erreichen.
Darüber hinaus wird aufgrund der Instabilität von mRNA-LNPs und ihren Komponenten bei abschließenden Sterilisationsmethoden typischerweise ein 0,2 µm steriler-Filter verwendet, um Bakterien und andere mikrobielle Verunreinigungen zu entfernen.
