Anwendung der Ultrafiltration bei der Herstellung eines Tollwutimpfstoffs für Menschen

Um die Anwendung der Ultrafiltration bei der Herstellung von Tollwutimpfstoffen für Menschen zu fördern, wurde eine 300 kDa-Ultrafiltrationsmembrankassette verwendet, um die Tollwutvirus-Erntelösung zu konzentrieren und die Antigenrückgewinnung, die Endotoxinentfernungsrate und die Wirtsproteinentfernungsrate nach der Ultrafiltration zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigten, dass die Tollwutvirus-Erntelösung unter dem entsprechenden Druck 80-mal konzentriert und 25-mal eluiert wurde, die Antigenrückgewinnungsrate 86,2 %, die bakterielle Endotoxinentfernungsrate 87,5 % bis 88,7 % und die Wirtsproteinentfernungsrate 91,6 % betrug.

 

Vorwort

 

Tollwut ist eine traditionelle, alte Zoonose, die durch das Tollwutvirus (RV) verursacht wird und eine Sterblichkeitsrate von bis zu 100 % aufweist. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung für postexpositionelle Erkrankungen (d. h. Schädigungen der Haut und Schleimhäute) außer Notfallimpfungen und Immunglobulin-Impfungen. Die Hauptquelle der Tollwut beim Menschen sind Bisse von kranken oder potenziell infizierten Tieren (hauptsächlich Hunden). Die Sterblichkeitsrate durch Tollwut in China liegt weltweit an zweiter Stelle, und Tollwut ist eines der Probleme, die die öffentliche Gesundheitssicherheit in unserem Land bedrohen. Das Kapselglykoprotein des Tollwutvirus, das einzige Schlüsselantigen, das die Produktion schützender neutralisierender Antikörper induziert, steht im Mittelpunkt der Forschung und Entwicklung neuer Impfstoffe sowie neuer Diagnose- und Behandlungstechnologien für das Tollwutvirus.

 

Das Tollwutvirus gehört zur Gattung Tollwutvirus der Rhabdovirusfamilie. Die Form des Nukleokapsids ist elastisch, das Nukleokapsid ist spiralförmig symmetrisch und die Oberfläche hat eine Hülle, die einzelsträngige RNA enthält. Es ist der Erreger, der Tollwut verursacht. Das Tollwutvirus hat zwei Hauptantigene: eines ist das Glykoprotein-Antigen auf der äußeren Membran des Virus, das an den Acetylcholinrezeptor binden kann, wodurch das Virus neurotoxisch wird und neutralisierende Antikörper und Hämagglutination hemmende Antikörper im Körper produziert, und die neutralisierenden Antikörper haben eine schützende Wirkung; das andere ist das innere Riboprotein-Antigen, das den Körper dazu bringen kann, Komplementbindungsantikörper und Präzipitin zu produzieren und keine schützende Wirkung hat.

 

Endotoxin ist eine Art Lipopolysaccharidsubstanz (LPS), die hitzebeständig und chemisch stabil ist und nicht leicht zerstört werden kann. Wenn der Impfstoff eine bestimmte Konzentration an Endotoxin aufweist, kann dies nach der Impfung schweres Fieber und sogar den Tod verursachen. Daher sollte der Endotoxingehalt im Impfstoff so weit wie möglich reduziert werden. Die Ausgabe 2005 des chinesischen Arzneibuchs (Teil III) legt fest, dass der Kontrollwert des qualifizierten Index für Endotoxin im Tollwutimpfstoff nicht höher als 100 IE/Dosis sein darf. Mit der rasanten Entwicklung der Membrantrenntechnologie wird die Anwendung der Ultrafiltrationsmembrantrenntechnologie zur Reduzierung des Endotoxingehalts in Impfstoffen in der Pharmaindustrie immer weiter verbreitet.

 

Ein Tollwutimpfstoff ist ein Impfstoff gegen Tollwut. Es gibt normalerweise drei Arten von Tollwutimpfstoffen, darunter gereinigten Vero-Zellimpfstoff, humanen diploiden Zellimpfstoff und primären Zellkulturimpfstoff. Der Tollwutimpfstoff wird hergestellt, indem fixiertes Tollwutvirus in eine Zellmatrix eingeimpft wird, nachdem Kultur, Ernte, Konzentration, Inaktivierung, Reinigung und Zugabe eines geeigneten Stabilisators erfolgt sind. Die Hauptfunktion des Tollwutimpfstoffs besteht darin, den Körper zu einer schnellen Immunreaktion anzuregen und schützende Antikörper gegen das Tollwutvirus zu produzieren, um eine durch das Virus verursachte Infektion zu verhindern und das Krankheitsrisiko zu verringern.

 

 

Der Herstellungsprozess von Impfstoffen spielt eine wichtige Rolle bei der Sicherstellung seiner Qualität, insbesondere die Quantifizierung einiger Indikatoren im Herstellungsprozess ist von großer Bedeutung. Im Herstellungsprozess von Tollwutimpfstoffen für Menschen ist die Ultrafiltrationskonzentrationstechnologie ein notwendiges Mittel zur Herstellung von Tollwutimpfstoffen für Menschen. Durch die Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit angemessener Öffnung zur Ultrafiltrationskonzentration können Endotoxin und Wirtsprotein wirksam entfernt und das RV-Antigen zurückgehalten werden, was der Impfstoffproduktion und -qualitätsverbesserung förderlich ist. Die relative Molekularmasse von RV-Molekülen beträgt 350 bis 460 kDa und theoretisch kann RV durch Ultrafiltrationskonzentration unter Verwendung von Membrankassetten mit Abfangmolekulargewichten von 100 bis 300 kDa vollständig abgefangen werden. Endotoxin bildet in verschiedenen wässrigen Lösungen häufig Aggregatstrukturen. Aufgrund des Aggregationsgrades ist die Molekülgröße unterschiedlich. Die relative Molekularmasse von Endotoxinmonomeren beträgt 10 bis 20 kDa und die relative Molekularmasse seiner polymerisierten Form beträgt 300 bis 1.000 kDa oder mehr. Aufgrund der Unterschiede im Molekulargewicht blieb das RV-Antigen im Tollwutimpfstoff für Menschen erhalten und das Endotoxin und das Wirtsprotein im Tollwutimpfstoff für Menschen wurden durch eine 300 kDa-Ultrafiltrationsmembran entfernt.

 

In diesem Experiment wurde eine Ultrafiltrationsmembrankassette mit einer Öffnung von 300 kDa und einer Membranfläche von 0,11 m2 als Behandlung für eine kleine Probe verwendet, um Zwischenprodukte des menschlichen Tollwutimpfstoffs zu konzentrieren. Außerdem wurden Membranfluss, Behandlungseffizienz, Konzentrationsvielfaches, Antigenabfang, Endotoxinentfernung und Entfernung von Wirtsproteinen getestet.

 

2Materialmethode

 

2.1 Experimentelle Materialien

Tollwutvirus-fixierter Virusstamm CTN-IV; Vero-Zellen; 0,5 M Natriumhydroxid; 300 kDa Ultrafiltrationsmembrankassette (PES-Material, 0,11 m² Membranfläche).

 

2.2 Experimentelle Methoden

2.2.1 Herstellung der Viruserntelösung

Gefrorene Vero-Zellen wurden in warmem Wasser bei 37 - 39 °C wiederbelebt, die Zellsuspension wurde abgesaugt und dann zu 199 g Kulturmedium mit 1 6 % inaktiviertem Kälberserum hinzugefügt. Einheitliche Monolayer-Zellen wurden bei 37 °C kultiviert. Der CTN-IV-Stamm wurde mit Tollwutvirus in einem Verhältnis von 11,1 mol/l geimpft und bei 37 °C kultiviert. Nach 48 h wurde das Kulturmedium verworfen und 199 g Kulturmedium mit 0,1 % menschlichem Blutalbumin hinzugefügt, um die Kultur bei 33 - 35 °C zu halten. Das Krankheitsgift wurde alle 3 Tage geerntet und die mehrfach geernteten Flüssigkeiten wurden kombiniert.

 

2.2.2 Einbau der Membrankassette

Bauen Sie die Membrankassette ein und schließen Sie die Verkabelung wie in der Abbildung unten gezeigt an.

 

2.2.3 Waschen mit Wasser

Schließen Sie das Einlassventil, das Rücklaufventil und das Durchgangsventil und stecken Sie das Rücklauf- und Durchgangsrohr in den Abfallflüssigkeitstank. Füllen Sie den Ansaugtank mit 1 l Wasser für Injektionszwecke.

Öffnen Sie die Einlass- und Rücklaufventile, schließen Sie die Durchgangsventile, öffnen Sie die Pumpe, reinigen Sie die Rücklaufleitung mit 10 % Volumen gereinigtem Wasser oder Wasser für Injektionszwecke und halten Sie den Einlassdruck bei 0,35 Bar (5 psi).

Öffnen Sie das Filterventil, schließen Sie das Rücklaufventil und verwenden Sie das verbleibende Injektionswasser, um das Filterrohr zu reinigen. Halten Sie dabei den TMP bei 0,35 Bar.

 

2.2.4 Desinfektion

Schließen Sie das Einlassventil, das Rücklaufventil und das Getriebeventil und führen Sie die Rücklauf- und Getriebeleitungen in den Abfallflüssigkeitstank ein. Füllen Sie den Ansaugtank mit 2 l Reinigungslösung.

Öffnen Sie die Einlass- und Rücklaufventile, schließen Sie die Durchgangsventile, öffnen Sie die Pumpe, reinigen Sie die Rücklaufleitung mit 200 ml 0,5 M Natriumhydroxid und halten Sie den Einlassdruck bei 0,35 Bar (5 psi).

Öffnen Sie das Durchgangsventil, schließen Sie das Rücklaufventil und reinigen Sie das Durchgangsrohr mit einer Menge von 200 ml Reinigungslösung. Halten Sie dabei den TMP bei 0,35 Bar.

Anschließend werden das Rücklaufende und das Durchgangsrohr zur zyklischen Reinigung in den Flüssigkeitstank eingeführt. Zyklische Reinigung mit dem 1- bis 1,5-fachen der tangentialen Prozessdurchflussrate für 30 Minuten.

0,5 M Natriumhydroxid ablassen und gemäß 2.2.4 mit Wasser für Injektionszwecke neutral spülen.

 

2.2.5 Wasserflusstest

Geben Sie gereinigtes Wasser in den Einlasstank, messen und notieren Sie die Wassertemperatur im Einlasstank. Stecken Sie das Rücklaufende in den Tank. Starten Sie die Pumpe und stellen Sie die Pumpengeschwindigkeit und das Rücklaufventil ein, um eine transmembranäre Druckdifferenz von 0,35 bar (5 psi) zu erreichen. Messen und notieren Sie mit einem Zylinder die Durchflussrate am Durchgangsende in ml/min. Passen Sie die Pumpengeschwindigkeit und das Rücklaufventil an, um einen transmembranären Differenzdruck von 1 bar (15 psi) zu erreichen. Messen und notieren Sie mit einem Zylinder die Durchflussrate am Durchgangsende in ml/min.

Um den Wasserdurchflusswert zu standardisieren, dividieren Sie den berechneten Wasserdurchflusswert durch die transmembrane Druckdifferenz und multiplizieren Sie den Temperaturkorrekturfaktor in der folgenden Tabelle.

 

2.2.6 Ultrafiltrationskonzentration

Spülen Sie das Wasser mit dem Pufferaufsatz aus dem System. Führen Sie einen 5-minütigen Zyklus durch, um den pH-Wert und die Ionenstabilität des Systems anzupassen. Wenn die Temperatur angepasst werden muss, setzen Sie den Zyklus fort, bis die Systemtemperatur stabil ist.

Geben Sie die Zufuhrflüssigkeit in den Ansaugbehälter, stellen Sie eine Zufuhrdurchflussrate ein (z. B. 400 LMH) und testen Sie die Durchflussrate bei verschiedenen TMP-Werten. Gemäß den Testdaten wurden Kurven mit TMP als Abszisse und Flux als Ordinate gezeichnet.

Führen Sie das Durchgangsrohr in einen geeigneten Behälter oder Abfluss, beispielsweise Durchgangssammeltanks, Abfallflüssigkeitstanks oder Prozessabläufe.

Notieren Sie das Anfangsgewicht der Zufuhrflüssigkeit im Zufuhrtank, starten Sie die Zufuhrpumpe und lassen Sie die Zufuhrflüssigkeit 3 ​​bis 4 Minuten lang langsam zirkulieren. Durch die Umwälzung kann die Restluft im Strömungsweg entfernt werden, wodurch die Leistung des Films maximiert wird.

Öffnen Sie das Durchgangsventil, erhöhen Sie langsam die Pumpengeschwindigkeit, bis die optimale tangentiale Durchflussrate erreicht ist, und stellen Sie das Rücklaufventil ein, um den optimalen TMP des Systems zu erreichen.

Legen Sie dann das Rohr in den Auffangbehälter, starten Sie die Zeitmessung, wenn die Flüssigkeit in den Behälter gelangt, und zeichnen Sie den Einlass- und Rücklaufdruck in geeigneten Abständen auf. Zeichnen Sie außerdem die Qualität der Flüssigkeit im Zeitverlauf am Rücklaufende und am Durchflussende auf, um die momentane Durchflussrate zu berechnen.

Die Ultrafiltrationskonzentration der Probe ist abgeschlossen, wenn das Flüssigkeitsvolumen des Zulaufs auf das Zielkonzentrationsvolumen reduziert ist.

 

2.2.7 Dialyse

Legen Sie das Ansaugrohr, das Nachfüllrohr und das Rücklaufrohr in den Ansaugbehälter, legen Sie das Übertragungsrohr in den Auffangbehälter und stellen Sie den Auffangbehälter zum Reinigen auf die Waage.

Öffnen Sie das Rücklaufventil, starten Sie die Einlasspumpe, öffnen Sie das Durchgangsventil, stellen Sie die Pumpengeschwindigkeit und TMP auf den entsprechenden Wert ein. Öffnen Sie die Nachfüllpumpe, halten Sie das Flüssigkeitsvolumen im Ansaugbehälter unverändert und starten Sie die Dialyse mit gleichem Volumen. Starten Sie die Zeitmessung, wenn die Flüssigkeit in den Behälter gelangt, und zeichnen Sie den Druck am Einlassende, am Rücklaufende und die Masse der Flüssigkeit im entsprechenden Zeitintervall auf und ermitteln Sie die momentane Durchflussrate durch Berechnung.

 

2.2.8 KVP

Zuerst mit Puffer spülen, dann mit Wasser für Injektionszwecke spülen (Vorgang 2.2.3), dann mit Reinigungsmittel reinigen (Vorgang 2.2.4) und abschließend mit Wasser für Injektionszwecke spülen (Vorgang 2.2.3).

 

2.2.9 Wasserflusstest

Die Funktionsweise ist wie folgt: 2.4.5.

 

2.2.10 Konservierung der Membrankassette

Kurzzeitlagerung (weniger als oder gleich 3 Tage): Belassen Sie die Membrankassette in der Vorrichtung und lassen Sie die Aufbewahrungslösung 10 bis 15 Minuten lang zirkulieren, schließen Sie das Systemventil, unterbrechen Sie die Stromversorgung der Flüssigkeitspumpe und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitszulauftank richtig abgedichtet ist.

Wenn die Lagerzeit 3 ​​Tage bis 1 Monat beträgt, entfernen Sie die Membrankassette aus der Vorrichtung und verschließen Sie sie in einer Plastiktüte oder einem anderen luftdichten Behälter. Geben Sie etwa 50 bis 100 ml der Lagerlösung in eine Plastiktüte oder einen luftdichten Behälter und verschließen Sie diesen. Alternativ kann die Kassette auch direkt in die Lagerlösung getaucht werden. Die folgende Tabelle empfiehlt Lagerbedingungen.

 

3 Ergebnisse und Analyse

 

3.1 Untersuchung von Einflussfaktoren auf die Pyrogenentfernungseffizienz

Betriebsdruck der Ultrafiltration: 15 Testchargen wurden kontinuierlich betrieben. In jeder Charge wurde der Filtrationsdruck während der Ultrafiltration bei 5, 10, 15 und 2{{10}}psi gehalten, und die Virusernteflüssigkeit wurde 30-fach konzentriert und mit Pufferflüssigkeit (10-faches Volumen) im kontinuierlichen Fluss eluiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: Die Entfernungsrate von Endotoxin betrug weniger als 87,0 %, die Rückgewinnungsrate von Antigen war stabil bei 86,0 % und die Entfernungsrate von Wirtsprotein war stabil bei 90,0 %, was darauf hindeutet, dass unterschiedliche Betriebsdrücke wenig Einfluss auf die Wirkung der Antigenrückgewinnung, der Endotoxinentfernung und der Entfernung von Wirtsprotein hatten.

Ultrafiltrationskonzentrationsverhältnis: 15 Testchargen wurden kontinuierlich durchgeführt. In jeder Charge wurde die Virusernteflüssigkeit während der Ultrafiltration 30-fach, 50-fach, 80-fach und 100-fach konzentriert. Der Filtrationsdruck wurde bei 20 psi gehalten und die Pufferflüssigkeit (10-faches Volumen) wurde im kontinuierlichen Fluss eluiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: Die Entfernungsrate des Endotoxins lag zwischen 53,3 % und 86,9 %, die Antigen-Wiedergewinnungsrate blieb stabil bei 86,0 % und die Entfernungsrate des Wirtsproteins blieb stabil bei 91,0 %. Bei der segmentierten Probenahme wurde in der Übertragungslösung kein Antigen nachgewiesen und weniger als 10 % des Wirtsproteins blieben in der konzentrierten Viruslösung. Die Endotoxinkonzentration in der konzentrierten Viruslösung nahm mit zunehmender Konzentration zu. Die Endotoxinentfernungsrate war bei der 80-fach konzentrierten Probe am höchsten. Der Hersteller konnte auch eine 100-fache Konzentration in Betracht ziehen, was nicht nur die Produktionseffizienz verbesserte und die Kosten senkte, sondern auch den Anforderungen der Impfstoffproduktion entsprach.

 

3.2 Flussverarmung und Reinigungsregeneration der Membrankassette

Nach der Behandlung betrug die Membranflusswiederherstellungsrate 92,6 %. Die erste Wiederherstellungsrate der neuen Membrankassette ist normal. Gemäß den aktuellen Beobachtungseigenschaften der Zufuhrflüssigkeit und der anschließenden Vorhersage des zweiten und NTH-Zeitpunkts wird die Membrankassettenflusswiederherstellungsrate nach dieser Behandlung nahe an den Daten liegen und tendenziell stabil sein. Innerhalb von 2 Stunden einmaliger Verwendung war die Erschöpfung der Membrankassette ideal und während des gesamten Betriebs wurden nur 10 % des Membranflusses erschöpft.

3.2.1 Flussverarmung im Prozess der Membrankassettenbehandlung

3.2.2 Ergebnis der Reinigung und Regeneration der Membrankassette

 

Informationen Guidling

 

Guidling Technology ist ein nationales Hightech-Unternehmen mit Schwerpunkt auf Biopharmazeutika, Zellkulturen, Reinigung und Konzentration von Biomedizin, Diagnose und Industrieflüssigkeiten. Wir haben erfolgreich Zentrifugalfiltergeräte, Ultrafiltrations- und Mikrofiltrationskassetten, Virenfilter, TFF-Systeme, Tiefenfilter, Hohlfasern usw. entwickelt, die die Anwendungsszenarien von Biopharmazeutika, Zellkulturen usw. vollständig erfüllen. Unsere Membranen und Membranfilter werden häufig zur Konzentration, Extraktion und Trennung von Vorfiltration, Mikrofiltration, Ultrafiltration und Nanofiltration eingesetzt. Unsere zahlreichen Produktlinien, von kleinen Einweg-Laborfiltrationen bis hin zu Produktionsfiltrationssystemen, Sterilitätstests, Fermentationen, Zellkulturen und mehr, erfüllen die Anforderungen von Tests und Produktion. Guidling Technology freut sich auf die Zusammenarbeit mit Ihnen!