Studie zur Anwendung der Tiefenfiltration im Produktionsprozess von Maul- und Klauenseuche-Impfstoffen
Vorwort – Was ist Maul- und Klauenseuche?
Aus dem 14. Jahrhundert gibt es schriftliche Aufzeichnungen über eine ähnliche Maul- und Klauenseuche in Europa. Die Maul- und Klauenseuche ist eine akute, fieberhafte, hochansteckende Krankheit, die durch das Maul- und Klauenseuchevirus verursacht wird.
Zu den klinischen Symptomen erwachsener Tiere gehören: erhöhte Körpertemperatur, Blasen und Geschwüre im Maul, Blasen und Geschwüre im Huf und sogar das Ablösen von Hufschalen, was zu Schwierigkeiten beim Fressen und Schlafen, Gewichtsverlust und sogar einem Verlust des wirtschaftlichen Wertes bei Nutztieren führt ;
Zu den klinischen Symptomen junger Tiere gehören: erhöhte Körpertemperatur, Myokarditis und andere Symptome. Sobald die Krankheit auftritt, kommt es bei jungen Tieren zu einer hohen Sterblichkeit.
Abstrakt
In den letzten 500 Jahren ist weltweit immer wieder die Maul- und Klauenseuche ausgebrochen, eine große Zahl von Schweinen, Rindern, Schafen und anderen Haustieren sowie wildlebenden Paarhufern sind gestorben oder erkrankt, was schwere Auswirkungen auf die Nutztiere hatte und Zuchtindustrie.
Um die Anwendung der Tiefenfiltrationstechnologie im Produktionsprozess von Maul- und Klauenseuche-Impfstoffen zu untersuchen, wurden die Filtrierbarkeitsleistung von Oberflächenfiltration und Tiefenfiltration sowie die Schutzwirkung der bakteriziden Filtration getestet und verglichen. Die Vorteile der Hochladungstiefenfiltration bei der Entfernung von Zelltrümmern wurden untersucht. Die entsprechenden Filtrationsschemata für Zellkulturmedium mit unterschiedlicher Trübung wurden analysiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Tiefenfiltrationslast das 13,9-fache der Oberflächenfiltration betrug, die Trübung der Filterflüssigkeit nur 23,5 % der Oberflächenfiltration betrug und die anschließende Debakterialisierungslast von 0,2 µm das 7,2-fache der Oberflächenfiltration betrug Oberflächenfiltration. Durch die Verwendung seines speziellen Harzliganden beträgt die Trübung der Filterflüssigkeit 38,6 % der Trübung eines gewöhnlichen Tiefenfilters mit derselben Porengröße, was sich positiv auf den Schutz des nachgeschalteten Prozesses auswirkt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Tiefenfiltration, insbesondere die Tiefenfiltration mit starker positiver Ladung, effektiv auf die Produktion von MKS-Impfstoffen angewendet werden kann und dass geeignete Filtrationsverfahren für verschiedene Kulturmedien etabliert werden sollten.
Maul- und Klauenseuche und Tiefenfiltration
Die Maul- und Klauenseuche (MKS) ist eine akute, fieberhafte und ansteckende Erkrankung von Paarhufern, die durch das Maul- und Klauenseuche-Virus (MKSV) verursacht wird. Zu den Tieren, die am anfälligsten für diese Krankheit sind, gehören Rinder, Schweine und Schafe. Die Maul- und Klauenseuche ist in Asien, Afrika, dem Nahen Osten und Südamerika endemisch, mit sehr hoher Inzidenz und schneller Übertragung. Die Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) listet sie als erste zoonotische Krankheit der Kategorie A und verpflichtet die Mitgliedstaaten, die Maul- und Klauenseuche in die Liste der meldepflichtigen Tierseuchen aufzunehmen. Die Impfung ist ein wirksames Mittel zur gezielten MKS-Prävention. Der inaktivierte MKS-Impfstoff, der durch die Inaktivierung intakter Viren mit einem Inaktivator hergestellt wird, spielt eine wichtige Rolle bei der Prävention und Bekämpfung von MKS.
Die Antigenität von FMDV selbst ist gering und die Inaktivierung des Virus hat große Auswirkungen auf sein Antigen. Daher kann bei der aktuellen Produktion von MKS-Impfstoffen ein hochreiner MKS-Impfstoff den Antigengehalt und die Reinheit der Einheitsdosis sicherstellen, was besonders wichtig ist und auch die aktuelle Impfstrategie darstellt. Dies stellt hohe Anforderungen an die nachgeschaltete Reinigung von Viren. Darüber hinaus wurde vor 2009 in China bei inaktivierten Maul- und Klauenseuche-Impfstoffen meist die Kulturmethode des Drehens der Flasche und des Anbringens an der Wand angewendet. Mit der steigenden Nachfrage nach Impfstoffen traten nach und nach die Nachteile dieser Kulturmethode zutage, die eine große Anzahl rotierender Flaschen, eine geringe Effizienz und ein niedriges Expressionsniveau erfordert.
Daher hat sich die Zellkulturtechnologie in den letzten Jahren langsam von der bisherigen adhärenten Kultur zur Suspensionskultur verändert und die Virusproduktion deutlich verbessert. Mit der Zunahme der Virusproduktion hat die Änderung des Kulturmodus jedoch einen größeren Druck auf die nachgelagerte Reinigung mit sich gebracht, da die durch den Kulturprozess erzeugten Zelltrümmer, die Zellfreisetzung von Wirtsproteinen, Wirts-DNA usw. entsprechend zugenommen haben, was zu einem Anstieg der Virusproduktion führt stellt weitere Anforderungen an die nachgeschaltete Reinigungsfähigkeit.
Die Membranfiltrationstechnologie wird häufig im Produktionsprozess von biologischen Produkten wie Impfstoffen eingesetzt, wobei die DC-Filtrationstechnologie üblicherweise im Ernteprozess von Krankheitsgiften eingesetzt wird, um unlösliche Verunreinigungen wie Zelltrümmer abzutrennen. Bei der frühen FMDV-Klärung wurde hauptsächlich die Oberflächenfiltrationstechnologie übernommen, die durch das Faltmembranfilterelement repräsentiert wird. Mit der Änderung der Kulturbedingungen und der Zunahme von Zelltrümmerverunreinigungen ist es für die Oberflächenfiltration schwierig, den Klärungseffekt zu erzielen, und da die Oberflächenfiltrationsbelastung gering ist, werden die Kosten für Filtermaterialien immer höher.
Vor diesem Hintergrund wird die Tiefenfiltration immer häufiger im Prozess der Zytoflüssigkeitstrennung von FMDV eingesetzt. Das Tiefenfiltermaterial besteht normalerweise aus langen und feinen Fasern natürlichen Ursprungs, und der Kanal, den das Filtermedium nach der Filmbildung bildet, ist oft sehr gewunden, ähnlich der Labyrinthöffnungsstruktur. Verunreinigungspartikel werden oft im Filter und nicht an der Oberfläche festgehalten. Darüber hinaus absorbiert die Wand des Filterkanals häufig einen Teil der extrem feinen Partikelverunreinigungen durch elektrostatische Wirkung oder intermolekulare Kräfte. Im Allgemeinen ist der Filtrationsmechanismus der Tiefenfiltration durch mechanische Retention und Adsorption gekennzeichnet.
Konstantstrom-Filtrationsmethode
Installieren Sie die Tieffilterplatte am Konstantstromfiltergerät und waschen Sie die Filterplatte mit Puffer PBS über 54 L/m2. Nachdem der Waschvorgang abgeschlossen ist, starten Sie die Peristaltikpumpe, um die Flüssigkeit langsam zu pumpen, stellen Sie die Pumpengeschwindigkeit langsam auf etwa die erwartete Durchflussrate ein und filtern Sie die Flüssigkeit. Notieren Sie das Filtrationsvolumen, die Zeit, den Druckunterschied und die Trübung während des Filtrationsprozesses. Das Filtrat wurde zum Antigennachweis gesammelt.
Vorteile der Tiefenfiltration
Oberflächenfiltration ist eine Technologie, die Partikel auf der Oberfläche des Filtermaterials einfängt, um eine Filtration zu erreichen. Der Filtrationsmechanismus basiert hauptsächlich auf der Größe der Partikel im Flüssigkeitssieb. Große Partikel werden auf der Oberfläche der Filtermembran gefangen. Die Tiefenfiltration nutzt interne Kanäle zum Abfangen und Adsorbieren von Partikeln in der Tiefe. Das Vergleichsdiagramm der beiden ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die inaktivierte Lösung des Maul- und Klauenseuche-Impfstoffs eines bestimmten Herstellers wurde mit einer Polypropylen-Oberflächenmembran von 0,45 µm bzw. einer Tiefenfilterplatte vorgefiltert und anschließend mit einem bakteriziden Filter von 0,2 µm gefiltert. Die Filtrierbarkeitsdaten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Die Trübung der mit dem Maul- und Klauenseuche-Impfstoff inaktivierten Lösung beträgt 77 NTU. Wenn die Bakterien direkt gefiltert werden, führt eine große Anzahl von Zellfragmenten unweigerlich dazu, dass die 0.2um-Filtermembran schnell blockiert wird, was die Übertragung von 146S-Vipartikeln beeinträchtigt. Daher wurde vor der Debakterialisierungsfiltration eine Vorfiltration konzipiert und die beiden Vorfiltrationsmethoden Tiefenfiltration und Oberflächenfiltration verglichen. Für die Filtration wird die doppellagige Tiefenfilterplatte ausgewählt, die Beladung beträgt 641 l/m², und der Tiefenfilter reduziert das Material von 77 NTU auf 9,65 NTU, was klar und hell ist. Die Oberflächenfiltrationslast von 0.45um beträgt nur 46 l/m2 und die Trübung der Filterflüssigkeit beträgt bis zu 41 NTU, was für die Vorfiltration nicht geeignet ist. Gemäß dem Vergleich der anschließenden debakteriellisierten Filtrationslast von 0.2um beträgt die debakterielle Filtrationsmembranlast nach der Tiefenfiltration 655 l/m2, was dem 7,2-fachen der entsprechenden Oberflächenfiltrationsfiltrationslast (nur 91 l/m2) entspricht. .
146S-Testergebnisse zeigen, dass die Ausbeute eines Tiefenfiltrationssystems höher ist als die eines Oberflächenfiltrationssystems. Die Tiefenfiltrationslast betrug das 13,9-fache der Oberflächenfiltration, die Trübung der Filterflüssigkeit betrug nur 23,5 % der Oberflächenfiltration und die anschließende Bakterienentfernungsfiltrationslast von 0,2 µm betrug das 7,2-fache der Oberflächenfiltration. Daher ist das Tiefenfiltrationssystem sowohl aus Kosten- als auch aus Ertragssicht deutlich besser als das Oberflächenmembranfiltrationssystem.
Vorteile eines Tiefenfilters mit starker positiver Ladung
Die Tiefenfilterplatte mit positiver Ladung und die Tiefenfilterplatte mit starker positiver Ladung wurden verwendet, um die inaktivierte Lösung des Maul- und Klauenseuche-Impfstoffs aus verschiedenen Quellen zu vergleichen. Die Ergebnisse der Filtrierbarkeit sind in Tabelle 2 dargestellt, und die Änderung der Filtrationsgeschwindigkeit und der Druckdifferenz im Filtrationsprozess ist im Farblayout 2 dargestellt.
Die beiden verwendeten Gruppen von Tieffilterplatten haben die gleiche Öffnungsgenauigkeit, und die Leistung ist im Hinblick auf Last- und Druckdifferenzänderung sehr konstant, und die Druckdifferenzänderungskurve in Abbildung 2 ist grundsätzlich identisch.
Aufgrund der Trübung der Filterflüssigkeit ist der Unterschied jedoch sehr groß. Die Filterflüssigkeit der gewöhnlichen positiv geladenen Doppelschichtfilterplatte beträgt 25 NTU, während die Filterflüssigkeit der stark positiv geladenen Tiefenschichtfilterplatte mit derselben Öffnung nur 9,65 NTU beträgt, was nur 38,6 % der gewöhnlichen Tiefenfilterplatte entspricht. Dies ist vor allem auf den speziellen Harzliganden im stark positiv geladenen Tiefenfilterplatten-Filtermaterial zurückzuführen. Durch die stark positive Doppelschichtfilterplatte wird die Trübung auf weniger als 10NTU reduziert und die Zellfragmente werden vollständig adsorbiert bzw. eingefangen, was der anschließenden Ultrafiltration bzw. bakteriziden Filtration förderlich ist. Zusätzlich zum Adsorptionseffekt auf unlösliche Zelltrümmer berichteten Yigzaw Y et al. auch über den Entfernungseffekt einer stark positiv geladenen Tiefenfilterplatte auf Zellwirtsprotein, und Dorsey N et al. berichteten über den Entfernungseffekt einer stark positiv geladenen Tiefenfilterplatte auf DNA.
Einrichtung eines Klärfiltrationsverfahrens für den Überstand des Maul- und Klauenseuche-Impfstoffs durch Tiefenfiltration
Durch die obige Vergleichsstudie der Oberflächenfiltration und Tiefenfiltration sowie die Untersuchung der Klärwirkung der speziellen Tiefenfilterplatte mit starker positiver Ladung sollten verschiedene Filtrationsschemata auf den inaktivierten Überstand des unter verschiedenen Bedingungen hergestellten Maul- und Klauenseuche-Impfstoffs abgestimmt werden Kulturbedingungen. Für Zentrifugenüberstand mit drei verschiedenen Trübungen, geringer Trübung, mittlerer Trübung und hoher Trübung, sind das Tiefenfiltrationsschema und die entsprechenden Filtrationsparameter in Tabelle 3 aufgeführt.
Für den Zentrifugenüberstand mit geringer Trübung kann die einschichtige Tiefenfilterplatte eine kleine Menge Zelltrümmer effektiv klären und entfernen. Für den Zentrifugalüberstand mit mittlerer Trübung kann die doppelschichtige Tiefenfilterplatte eine wirksame Klärung bewirken, insbesondere kann die Tiefenfilterplatte mit starker positiver Ladung die Trübung auf weniger als 5 NTU reduzieren; Bei Zentrifugenüberständen mit höherer Trübung kann die kombinierte Filterplatte effektiv geklärt werden. Unabhängig vom Verfahren beträgt die Verarbeitungskapazität 500 bis 800 l/m2, die Trübung der Filterflüssigkeit beträgt weniger als 20 NTU und das Zielantigen wird vollständig zurückgewonnen, was für die Produktion im großen Maßstab geeignet ist.
Diskussion
In den 1970er Jahren wurde festgelegt, dass für die Filtermedien keine Asbestmaterialien verwendet werden dürfen, da Asbestmaterialien Karzinogene enthalten. Das Tiefenfiltermaterial enthält kein Asbest und hat eine stärkere positive Ladung. Das Filtermaterial besteht aus Holzfasermatrix und Filterhilfsmittel. Im Produktionsprozess wird Polymerharz verwendet, um die Grundkomponenten zu verbinden, und die darin enthaltenen funktionellen Gruppen mit positiver Ladung sorgen effektiv für die Ladungsadsorptionsfähigkeit des Tiefenfiltermaterials. Die hervorragende Leistung der adsorptiven Tiefenfiltration hinsichtlich der Aufnahmefähigkeit feiner Partikel ist in Abbildung 3 dargestellt.
In diesem Experiment wurden verschiedene Harzkomponenten und unterschiedliche Präzisionstiefenfiltermaterialien ausgewählt, um den Filtrationstest der FMDV-Kulturlösung zu klären, und der Vergleichstest wurde mit Oberflächenfiltration durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Tiefenfiltration für die Entfernung von Zelltrümmern besser geeignet war als die Oberflächenfiltration, was sich positiv auf die anschließende Filtrationseinheit zur Kontrolle der mikrobiellen Belastung auswirkte (0.2um). Darüber hinaus zeigt der Vergleich der Filterwirkung der stark positiv geladenen Tiefenfilterplatte und der gewöhnlichen positiven Ladung tiefen Filterplatte, dass die stark positiv geladene Filterplatte eine starke Fähigkeit zur Trübungskontrolle zeigt, wodurch die Trübung auf weniger als 5 NTU reduziert werden kann ist sehr förderlich für die Verbesserung der Robustheit des gesamten Filtrationsprozesses.
Der vorgelagerte Kulturprozess hat großen Einfluss auf die Ernteschritte der Wirkstoffe. Durch Tests wurde in diesem Experiment schließlich ein skalierbares Filtrationsschema für Zellkulturmedien mit unterschiedlicher Trübung etabliert, das eine gewisse richtungsweisende Bedeutung für die Produktion im großen Maßstab hat.
Der von Guidling Technology auf den Markt kommende Tiefenfilter ist ein Scheibenfilterelement, eine Art effizientes Filterelement mit Tiefenfilterpappe als Filtermaterial, das die regulatorischen Anforderungen der Biopharmazeutika vollständig erfüllt und hauptsächlich speziell für die Entfernung von entwickelt und hergestellt wird große Feststoffinhalte wie Zellen und Zellfragmente und können auf Zellkulturflüssigkeiten von Säugetieren angewendet werden; Klärung von Lysaten aus Bakterien und Hefezellen; Entfernung von Wirtszellprotein (HCP); Virus und DN entfernen; Entfernung von Endotoxinen; Die Entfernung von Entschäumer.
Das Produkt bietet die Vorteile eines kleinen Totvolumens, einer linearen Verstärkung, einer Scheibenkapselstruktur, eines kompakten Strukturdesigns und kann in Reihe mit anderen Geräten verwendet werden, hat einen geringen Platzbedarf, eine stabile Durchflussrate, eine lange Lebensdauer und niedrige Kosten.
