Eine Anleitung zur hochwertigen rekombinanten Proteinreinigung: nachgeschaltete Prozessoptimierung und tangentiale Strömungsfiltrationsanwendungen
Recombinant proteins are widely used in biopharmaceuticals, vaccine development, and in vitro diagnostics. Their purification quality directly impacts the activity, stability, and safety of the final product. Downstream purification is the critical step for obtaining high-purity, high-yield proteins. Tangential Flow Filtration (TFF) , due to its efficiency and Skalierbarkeit wird zunehmend zu einem wichtigen Werkzeug für Proteinreinigungsworkflows .
Dieser Artikel beschreibt systematisch die wichtigsten Schritte bei der nachgeschalteten Reinigung rekombinanter Proteine, wobei der Schwerpunkt auf den Anwendungsstrategien der TFF -Technologie . liegt, um Forschung und industrielle Benutzer bei der Optimierung von Reinigungsprozessen und Verbesserung der Proteinqualität . zu unterstützen
I . Kernschritte in der nachgeschalteten Reinigung rekombinanter Proteine
1. Zellernte und Lyse
Zentrifugation/Tiefenfiltration: Entfernt Zelltrümmer und Verunreinigungen; Geeignet für Bakterien, Hefe usw. ., Expressionssysteme .
Bohrung/Hochdruckhomogenisierung: Bricht die Zellen, um Zielproteine freizusetzen; Bedingungen erfordern eine Optimierung, um die Denaturierung der Protein . zu verhindern
Enzymatische Lyse: e . g ., Lysozymbehandlung für Bakterien; sanfte Bedingungen, aber höhere Kosten .
2. Primäre Reinigung: Erfassung des Zielproteins
Affinitätschromatographie (e . g ., His-Tag, Protein a/g): Hochspezifische Bindung; Erreicht eine hohe Reinheit in einem einzelnen Schritt .
Ionenaustauschchromatographie (IEX): Trennt Proteine basierend auf Ladungsunterschieden; Geeignet für die frühzeitige Bühnenreinigung .
Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC): Verwendet Unterschiede in der Hydrophobie der Proteinoberfläche; Wirksam für bestimmte schwer zu prüfende Proteine .
3. Polieren: Verbesserung der Reinheit
Größenexklusionschromatographie (SEC): Entfernt Aggregate und Kleinmolekülverunreinigungen; Begrenzte Ladekapazität .
Multimodale Chromatographie (e . g ., Capto haften): kombiniert mehrere Interaktionsmodi für eine höhere Auflösung .
4. Konzentration und Pufferaustausch
Ultrafiltration Zentrifugalgeräte: Geeignet für kleine Proben; Anfällig für Proteinverlust .
Tangential Flow Filtration (TFF): effizient, skalierbar, ideal für die industrielle Produktion (später detailliert) .
5. Sterilisation und Speicherung
0 . 22 µm Filtration: Entfernt Mikroorganismen, um die Sterilität zu gewährleisten.
Zugabe von Stabilisatoren (E . G ., Glycerol, BSA): verhindert Proteinabbau .
II . Schlüsselanwendungen der Tangentialflussfiltration (TFF) in der nachgeschalteten Reinigung
Tangential Flow Filtration (TFF) reduces membrane fouling via tangential flow, making it suitable for concentrating, desalting, and buffer exchanging large-volume samples. It offers significant advantages over dead-end filtration (e.g., ultrafiltration centrifugation).
1. Vorteile der TFF -Technologie
✔ Hohe Genesung: Minimiert Proteinadsorptionsverluste, insbesondere für Edelproben .
✔ Lineare Skalierbarkeit: Anwendbar von Laborskala (10 ml) bis Produktionsskala (1000L+) .
✔ Prozessflexibilität: Ein einzelnes System kann Konzentration, Dialyse (Pufferaustausch) und Diafiltration . durchführen
2. TFF -Kassette/Membranauswahlhandbuch
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Membranmaterial |
Eigenschaften |
Anwendungsszenarien |
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Polyethersulfon (PES) |
Niedrige Proteinbindung, chemisch stabil (pH -resistent), hoher Fluss |
Harte Pufferbedingungen |
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Regenerierte Cellulose (RC) |
Niedrige Proteinbindung, hoher Fluss und routinemäßiges Protein |
Routine Protein/Antikörperreinigung |
Auswahlrichtlinien für Molekulargewicht (MWCO):
1/3 bis 1/5 des Molekulargewichts des Zielproteins (e . g ., verwenden Sie eine 10 kDa -Membran für ein 30 kDa -Protein) .}
Um Aggregate zu entfernen, wählen Sie eine kleinere Porengröße (e {. g ., verwenden Sie eine 50 kDa -Membran für ein 100 kDa -Protein) .
3. Optimierung kritischer TFF -Betriebsparameter
Transmembrandruck (TMP): Typischerweise 3–15 psi; Übermäßig hoher TMP fördert das Fouling .
Tangentiale Durchflussrate: Turbulenz beibehält, um die Konzentrationspolarisation zu minimieren; Typischerweise 4–8 l/min · m² .
Ertragsverbesserungstechniken:
Verwenden Sie 2–5 Puffervolumina während der Diafiltration für den vollständigen Exchange .
Führen Sie am Ende eine Rückspannung durch, um das Restprotein . wiederherzustellen
4. Typische Fallstudie: monoklonaler Antikörper (mAb) Reinigung
Klärte Zellkulturflüssigkeit → Protein A Affinitätschromatographie → virale Inaktivierung mit niedriger Phil → TFF-Konzentration + Pufferaustausch → Polieren (Sek./IEX) → Sterile Filtration
TFF -Rolle:
Konzentriert schnell das verdünnte Protein A Eluat auf die Zielkonzentration .
Wechseln Sie den Puffer an PBS oder Formulierungspuffer aus (e . g ., Histidinpuffer) .
III . Häufige Probleme und Lösungen
❌ Problem 1: Niedrige Proteinwiederherstellung
Mögliche Ursachen: Membranadsorption; Niederschlag aufgrund von Überkonzentration .
Lösungen: Wechseln Sie auf niedrigbindende Membran; Tensid hinzufügen (e . g ., 0 . 01% Tween 20).
❌ Problem 2: Schneller Flussrückgang
Mögliche Ursachen: Membranverschmutzung oder Konzentrationspolarisation .
Lösungen: Tangentialflussrate optimieren; regelmäßige Backfluschen implementieren; Wechseln Sie zu einer offeneren Membranstruktur (e . g ., 30 kda anstelle von 10 kda) .
❌ Problem 3: Proteinaggregation
Mögliche Ursachen: übermäßige Scherkraft; ungeeigneter Puffer .
Lösungen: Pumpengeschwindigkeit reduzieren; Verwenden Sie sanftere Puffer (e . g ., das Saccharose oder NaCl) . enthält
IV . Zusammenfassung
Obtaining high-quality recombinant proteins relies on optimizing downstream purification processes. Tangential Flow Filtration (TFF) technology, with its efficiency and scalability, has become a critical tool for concentration and buffer exchange. By rationally selecting membrane cassettes, optimizing operational parameters, and integrating chromatography techniques, both protein purity and yield can be Die Anforderungen der Forschung und der Produktion von Industrie im industriellen Maßstab ..