Anwendung vonUltrafiltration inEExtraktion vonNnatürlichCKollagen

 

Ⅰ.Was ist Kollagen?

Kollagen ist ein Biopolymer, der Hauptbestandteil des Bindegewebes von Tieren und auch das am häufigsten vorkommende und am weitesten verbreitete funktionelle Protein bei Säugetieren. Es macht 25–30 % des Gesamtproteins aus, bei einigen sogar mehr als 80 % Organismen. Es spielt die Rolle des Bindegewebes in tierischen Zellen.

Der Messung zufolge verfügt ein Erwachsener über etwa 3 kg Kollagen in seinem Körper, das hauptsächlich in Haut, Knochen, Augen, Zähnen, Sehnen, inneren Organen (einschließlich Herz, Magen, Darm und Blutgefäßen) und anderen Teilen vorhanden ist des menschlichen Körpers. Seine Funktion besteht darin, die Morphologie und Struktur von Haut und Organen aufrechtzuerhalten, und es ist außerdem ein wichtiger Rohstoff für die Reparatur geschädigten Gewebes.

II. Extraktion von Kollagen aus Graskarpfenschuppen durch Ultrafiltration

1. Materialien und Methoden

1.1 Testmuster

Wässriger Extrakt aus Rohkollagen.

1.2 Testmethoden

1.2.1 Ultrafiltrationsprozess

1.2.2 Bestimmung des Vorfiltrationsprozesses

Bei diesem Test wird der optimale Vorfiltrationsprozess durch die vergleichende Analyse der Vakuumfiltrationsmethode und der Mikrofiltrationsmethode ermittelt. Die spezifischen Testmethoden sind wie folgt:

① Der wässrige Rohkollagenextrakt wird durch ein Filterpapier-Vakuumfiltrationsverfahren gefiltert, um suspendierte Partikel und Verunreinigungen im wässrigen Extrakt zu entfernen.

② Der wässrige Rohkollagenextrakt wird mit einer 0,2 μm-Mikrofiltrationsmembran filtriert, um unlösliche Substanzen, Verunreinigungen usw. im wässrigen Extrakt zu entfernen.

1.2.3 Auswahl der Porengröße der Ultrafiltrationsmembran

Während der Reinigung beträgt die Porengröße der Ultrafiltrationsmembran 100 kDa.

1.2.4 Einzelfaktorexperiment des Ultrafiltrationsreinigungsprozesses

Der wässrige Extrakt aus Rohkollagen wird durch Ultrafiltrationstechnologie gereinigt. Studieren Sie das Einzelfaktorexperiment zum Einfluss von Betriebsdruck, Betriebstemperatur und pH-Wert auf die Kollagenretention. Nachdem Sie das Ultrafiltrationsgerät eine Zeit lang in Betrieb genommen haben, untersuchen Sie die Auswirkung verschiedener Faktoren auf die Kollagenretentionsrate.

1.2.5 Berechnungsformel

2. Ergebnisse und Analyse

2.1 Analyse des Vorfiltrationsprozesses

In der folgenden Tabelle finden Sie die Vergleichsergebnisse der Vakuumfiltrationsmethode und der Mikrofiltrationsmethode.

Filtrationsmethode	Lösungskonzentration vor der Filtration/(g/L)	Lösungskonzentration nach der Filtration/(g/L)	Sinnesphänomene
Vakuumfiltrationsverfahren	0.45	0.35	Am Ende der Filtration ist die Lösung klar, nach einiger Zeit wird sie jedoch trüb.
Mikrofiltrationsmethode	0.45	0.42	Die Lösung ist am Ende der Filtration klar und bleibt auch nach längerem Stehen klar

 

Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass sowohl die Vakuumfiltrationsmethode als auch die Mikrofiltrationsmethode die Verunreinigungen und unlöslichen Feststoffe in der Lösung entfernen können, die Mikrofiltrationsmethode jedoch eine bessere Schutzwirkung auf Proteine ​​hat, d. h. der Verlust ist nicht signifikant Die Vakuumfiltrationsmethode kann zu Proteinverlusten führen. Darüber hinaus ist das Filtrat nach einer gewissen Zeit der Vakuumfiltration trüb, während die Mikrofiltration immer noch klar und transparent ist. Daher wird die Mikrofiltration als Vorbehandlungsverfahren der Ultrafiltration ausgewählt.

2.2 Einzelfaktortest des Ultrafiltrationsprozesses

2.2.1 Einfluss des Ultrafiltrationsdrucks auf die Retentionsrate

Untersuchen Sie unter der Bedingung einer Temperatur von 40 Grad und eines pH-Werts von 9.0 die Auswirkungen verschiedener Ultrafiltrationsdrücke (0.07 MPa, 0.{ {11}}9 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa und 0,15 MPa) auf die Proteinretentionsrate. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

 

Wie aus der obigen Abbildung ersichtlich ist, nahm die Abfangrate des Proteins mit zunehmendem Betriebsdruck allmählich ab. Bei {{0}}.07 MPa beträgt die Proteinretentionsrate 96,53 %, bei einem Betriebsdruck von 0,15 MPa beträgt die Proteinretentionsrate 84,38 %. Dies liegt daran, dass die Trennung von Stoffen durch Ultrafiltration durch den Druckunterschied gesteuert wird. In diesem Bereich des niedrigen Betriebsdrucks können kleine molekulare Substanzen die Membran schnell passieren, makromolekulare Substanzen können jedoch von der Ultrafiltrationsmembran eingefangen werden und sich auf der Oberfläche der Membran und im Moment auf der Oberfläche der Membran und dem wässrigen Medium ansammeln Extrakt aus Konzentrationsunterschieden, um Konzentrationsunterschiede zu verursachen, Polarisationswiderstand; Mit steigendem Druck nimmt jedoch der Konzentrationspolarisationswiderstand allmählich zu und der Konzentrationsunterschied zwischen der Membranoberfläche und dem wässrigen Extrakt erreicht ein Gleichgewicht. Wenn der Druck dieses Gleichgewicht überschreitet, könnte eine Gelschicht auf die Membranoberfläche geschrieben werden (was mit der Theorie der Konzentrationspolarisation und der während der Ultrafiltration gebildeten Gelschicht übereinstimmt). Der Druck nimmt weiter zu, die Dicke der Gelschicht nimmt zu und das auf der Oberfläche der Membran verbleibende Protein nimmt zu, was zu einer niedrigen Retentionsrate führt. Um die Trennwirkung der Membran sicherzustellen, beträgt der optimale Betriebsdruckparameter 0,07 MPa.

2.2.2 Einfluss der Temperatur auf die Proteinretentionsrate

Untersuchen Sie unter der Druckbedingung {{0}}.11 MPa, pH 9,0 die Auswirkungen verschiedener Temperaturen (25 Grad, 30 Grad, 35 Grad, 40 Grad und 45 Grad) auf die Proteinretention. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

 

Wie in der obigen Abbildung gezeigt, steigt mit steigender Temperatur die Rückhalterate der Ultrafiltrationsmembran allmählich an und erreicht ihr Maximum bei 45 Grad, wobei die Rückhalterate 97,01 % beträgt. Da die Viskosität von Kollagen eng mit der Temperatur zusammenhängt: Wenn die Temperatur niedriger ist, ist die Viskosität von Kollagen größer, und daher bildet das Kollagen leicht Widerstand auf der Oberfläche der Membran, was zu einer geringen Retentionsrate führt. Wenn die Temperatur steigt, nimmt die Viskosität von Kollagen ab und die Wechselwirkung zwischen Kollagenmolekülen wird geschwächt, so dass die Stoffübertragungsrate erhöht und die Konzentrationspolarisation geschwächt wird, wodurch die Retentionsrate erhöht wird. Ein weiterer Grund für die Erhöhung der Retentionsrate besteht darin, dass die Temperatur steigt und die Löslichkeit von Kollagen entsprechend zunimmt und das Phänomen der Blockierung der Membran durch Kollagen verringert wird. Daher beträgt die optimale Temperatur für die Ultrafiltration 45 Grad.

2.2.3 Einfluss des pH-Werts auf die Proteinretention

Untersuchen Sie unter der Bedingung eines Drucks von {{0}}.11 MPa und einer Temperatur von 40 Grad die Auswirkungen verschiedener pH-Bedingungen, nämlich pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 und pH=10.0, auf die Retentionsrate . Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, die Retentionsrate nimmt mit zunehmendem pH-Wert allmählich zu. Dies liegt daran, dass die Ultrafiltrationsmembran eine Polyether-Ahornmembran mit negativer Ladung und Kollagen mit negativer Ladung unter alkalischen Bedingungen ist. Negativ geladene Kollagenmoleküle und Ultrafiltrationsmembranen mit derselben Ladung bilden einen sich gegenseitig ausschließenden Zustand, sodass Kollagenmoleküle nicht leicht an der Oberfläche bleiben der Membran ist nicht leicht, die Membran zu blockieren, daher ist der optimale pH-Wert der Ultrafiltration 8-10.

2.3 Optimierung des Ultrafiltrationsprozesses und Validierung der Ergebnisse

Die Analyse von Design-Expert8.05 Software zeigt, dass die optimalen Prozessparameter wie folgt sind: Betriebsdruck 0,14 MPa, Betriebstemperatur 40,98 Grad und Lösungs-pH=9,43. Unter diesen Bedingungen betrug die Rückhaltequote 92,551 %. Unter Berücksichtigung der Funktionsfähigkeit der tatsächlichen Parameter beträgt der Betriebsdruck 0,14 MPa, die Betriebstemperatur 40 Grad und der pH-Wert der Speiseflüssigkeit beträgt 9,50 unter den Ultrafiltrationsbedingungen. Die experimentelle Überprüfung wird gestartet, nachdem das System der Ultrafiltrationsvorrichtung stabil ist. Das erhaltene Ergebnis der Retentionsrate beträgt (92,61 0,1) % (n=3). Der vorhergesagte Wert der Gleichung ähnelt im Wesentlichen dem gemessenen Wert, was darauf hinweist, dass das vorhergesagte bedingte Parameterergebnis mit dem tatsächlichen bedingten Ergebnis übereinstimmt.

2.4 Ergebnisse der Elektrophoreseanalyse

Das gereinigte Kollagen wird durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert und die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung dargestellt.

Wie in der obigen Abbildung gezeigt, ist Spur 1 das gereinigte Kollagen in diesem Experiment und Spur 2 ist die Standardkollagenprobe der Wadensehne. Aus der SDS-PAGE-Elektrophorese ging hervor, dass das in diesem Experiment vorgeschlagene Kollagenprotein als Kollagen identifiziert werden konnte, die scheinbar undeutlichen Grenzen der a1-Peptidkette und der a2-Peptidkette jedoch nicht klar sind. Aus der Elektrophorese geht klar hervor, dass es keine anderen Proteinbanden gibt, und es konnte gefolgert werden, dass die Reinheit des gereinigten Kollagens hoch ist.